王 玲，年益瑩，薛 鵬，季曉彤，崔鈺婷，張公亮，侯紅漫，孫黎明,*

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

海參（Stichopus japonicus）是我國經(jīng)濟價值較高的海珍品之一，富含多糖、膠原蛋白、糖脂等功能活性因子，近年來產(chǎn)量逐年遞增。但是，海參自溶能力很強，在捕撈、運輸、貯藏以及加工過程中均可發(fā)生自溶，導致海參原料品質下降。前期研究表明，海參體壁和腸道中的一系列內(nèi)源性蛋白酶是海參自溶的主導因素，其中組織蛋白酶（cathespin，Cat）對海參自溶起重要作用[1-2]。

在所有Cat中，只有Cat D和Cat E屬于天冬氨酸蛋白酶（EC3.4.23）[3]。Cat D的分布非常廣泛，幾乎在所有組織中都有分布[4]；而Cat E分布則相對局限，只存在于部分組織細胞中[5]。它們雖然是天冬氨酸蛋白酶家族中2 種性質非常相似的蛋白酶，但Cat D分布于溶酶體中，在高等動物的胃部和在其他組織器官都有分布[6-8]。而Cat E并不是溶酶體蛋白酶，而是一種非分泌性的細胞內(nèi)蛋白酶。同一物種的Cat D和Cat E在理化特性、分子質量、存在形式[9-10]及抗原性[7,11]等方面均有一定差異。

Simon等[12]發(fā)現(xiàn)Cat D具有較強的纖維蛋白及纖維蛋白原溶解活性。Helseth等[13]發(fā)現(xiàn)Cat D參與原膠原纖維的降解，能夠將原膠原的羧基端前肽水解掉，當pH值為6時，斷裂位點從羧基端端肽移至羧基端端肽/前肽結合處。膠原蛋白是海參的主要結構蛋白，因此，海參內(nèi)源性Cat D及Cat E很有可能參與海參自溶。

海參Cat D和Cat E相關信息鮮見報道。本實驗以遼寧特產(chǎn)刺參體壁中的Cat D和Cat E為研究對象，對其部分酶學性質進行研究，包括最適pH值、最適溫度和熱穩(wěn)定性，以及金屬離子、蛋白酶抑制劑和激活劑對Cat D和Cat E活力的影響。進一步利用特異性抑制劑Pepstatin A，考察天冬氨酸蛋白酶對海參自溶過程中蛋白質降解的影響，為進一步闡明Cat D和Cat E在海參自溶中的作用機制及其控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活刺參購于大連長興市場，30 min內(nèi)于冰盒中運回實驗室。

MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2（Cat D底物）、MOCAc-Gly-Ser-Pro-Ala-Phe-Leu-Ala-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2（Cat E底物）、Z-Leu-Leu-Leu-H（Z-LLL）CA-074 日本Peptide Institute公司；E-64、抗痛素、苯甲基磺酸氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、1,10-菲啰啉、胃蛋白酶抑制劑（pepstatin A，Pep A） 美國Sigma公司；L-半胱氨酸（L-Cys）、碘乙酸、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（trismethyl aminomethane，Tris） 生工生物工程（上海）有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

熒光光譜儀 美國PE公司；PHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司；Z-323K型大容量冷凍離心機德國Hermle公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

新鮮刺參剖腹去腸，體壁用去離子水洗凈、切碎，按料液比1∶1（g/mL）加入Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH 7.0），勻漿，上述過程中均在冰浴下進行，4 ℃浸提1 h，離心（12 000 r/min，20 min），取上清液即為粗酶液，-80 ℃貯藏備用。1.3.2 酶學性質的測定

1.3.2.1 特異性熒光底物法測定酶活力

取150 μL粗酶液，加入75 μL Tris-HCl反應緩沖溶液(50 mmol/L，pH 7.0)，再加入75 μL（10 μmol/L）特異性底物，混勻后于37 ℃水浴30 min，立即加入300 μL終止液甲醇-異丙醇-水（35∶30∶35，V/V）終止反應，混勻后在各自激發(fā)波長和發(fā)射波長條件下（Cat D激發(fā)波長320 nm，發(fā)射波長400 nm；Cat E激發(fā)波長328 nm，發(fā)射波長393 nm）測定熒光強度，每組實驗均做3 次平行。

以熒光產(chǎn)物7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，MCA）物質的量（μmol）為橫坐標，在其激發(fā)波長346 nm和檢測波長439 nm條件下測得的熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為Y=10.06X-0.199 3（R2=0.999 9）。將酶活力定義為：在1 min內(nèi)水解底物并釋放1×10-3μmol的MCA產(chǎn)物的量為1 個酶活力單位（1 U）。相對酶活力定義為：各種條件下測得的酶活力相對最高酶活力（或對照組酶活力）的百分比。

1.3.2.2 最適pH值的測定

配制pH值分別為2～11的緩沖液作為反應緩沖液，按照1.3.2.1節(jié)中的方法測定不同pH值條件下Cat D和Cat E的活性。各反應緩沖液分別為：0.2 mol/L Gly-HCl 緩沖液（pH 2～3），0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖液（pH 4～5），0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6～8），0.2 mol/L Gly-NaOH 緩沖液（pH 9～10），0.2 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 11）。

1.3.2.3 最適溫度的測定

取150 μL粗酶液，加入75 μL最適pH值反應緩沖溶液，再加入75 μL底物，混合均勻，分別于10～80 ℃反應30 min后立即加入300 μL終止液，混勻后測定熒光強度。

1.3.2.4 熱穩(wěn)定性的測定

取150 μL粗酶液分別于20～80 ℃水浴30 min后，加入75 μL最適反應緩沖溶液，再加入75 μL底物，混合均勻。分別于最適溫度下反應30 min后立即加入300 μL終止液，混勻后測定熒光強度。

1.3.2.5 金屬離子對酶活力的影響

取75 μL粗酶液，加入150 μL含有10 mmol/L金屬離子Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+的最適緩沖溶液，常溫孵育30 min，加入75 μL底物，混合均勻。分別于最適溫度下反應30 min后加入300 μL終止液，混勻后測定熒光強度。對照組用最適pH值緩沖液代替金屬鹽溶液，其余操作不變。

1.3.2.6 抑制劑與激活劑對酶活力的影響

取75 μL粗酶液分別與含有20 μmol/L CA-074、2 mmol/L Z-LLL、2 mmol/L碘乙酸、20 μmol/L E-64、0.5 mmol/L抗痛素、2 mmol/L PMSF、2 mmol/L 1,10-菲啰啉、2 mmol/L DTT、2 mmol/L L-Cys、2 mmol/L EDTA的緩沖液等體積混合，室溫孵育30 min，加入75 μL最適pH值緩沖液和75 μL底物，分別于最適溫度下反應30 min，加入300 μL終止液，混勻后測定熒光強度。對照組用最適pH值緩沖液代替抑制劑，其余操作不變。

1.3.2.7 Pep A對刺參自溶的影響

將新鮮刺參切碎，勻漿，取2 g勻漿物加入試管中，再加入2 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0），分為4 組，每組3 管。第1組：立即加入2 mL蛋白提取緩沖液（2%十二烷基硫酸鈉，8 mol/L尿素，5% DTT，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），振蕩12 h，沸水浴5 min，離心（4 000 r/min，15 min），取上清液備用。第2組：于25 ℃孵育（自溶）6 h，然后加入2 mL蛋白提取緩沖液，后續(xù)步驟同第1組。第3、4組：添加終濃度分別為0.2、0.4 mmol/L的Pep A，于25 ℃孵育6 h，然后立即加入2 mL蛋白提取緩沖液，后續(xù)步驟同第1組。采用5%濃縮膠，8%分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳后，膠塊用清水洗滌后，于0.125%考馬斯亮藍R-250中染色3 h后，用甲醇-醋酸-水溶液脫色后進行凝膠成像。

2 結果與分析

2.1 Cat D和Cat E的最適pH值

圖1 Cat D和Cat E的最適pH值Fig.1 Optimum pH values for Cat D and Cat E

如圖1所示，隨著pH值的增大，Cat D和Cat E的酶活力分別在pH 5和pH 4時達到酶活力高峰；在隨后的酶活力下降過程中，兩者呈現(xiàn)一定差異，Cat E酶活性下降較為緩慢，而Cat D酶活性則快速下降。在pH 8～10范圍內(nèi)，Cat E的相對酶活力保持在40%左右，而Cat D的相對酶活力則僅為10%～17%。

關于Cat D的最適pH值研究報道較多。在水產(chǎn)動物方面，Venugopa等[14]發(fā)現(xiàn)貽貝Cat D的最適pH值為3.5。Goldman-Levkovitz等[15]測得鯉魚Cat D在pH 3.0呈現(xiàn)酶活力峰值，之后隨著pH值升高，活性直線下降，至pH 5.0時酶活性降為最大酶活力的40%以下。Wang等[16]測得大西洋鱈魚（Clupea harengus）肌肉中Cat D的最適pH值也為3.0，當pH值升至4.5和5.2時活性僅為最大酶活力的50%和20%。Balti等[17]研究了魷魚肝胰腺Cat D的理化特性，其最適pH值也為3.0。Liu Zhongyi等[18]報道草魚腸道Cat D的最適pH值為2.5。Nielsen等[19]測得大西洋鯡魚的最適pH值為2.5，當pH值升到4時，活性降低50%；當pH值為6時，酶活性幾乎為零。

在陸生動物方面，Krause等[20]報道了鴕鳥Cat D的最適pH值為4。Simon等[12]發(fā)現(xiàn)人Cat D最適pH值在3.5，在pH值為5時，酶活力則降為最大酶活力的50%。Yasuda等[21]測得大鼠胃和脾Cat D的最適pH值為4，當pH值升到6.5時，酶活力降為最大酶活力的10%以下。

上述結果表明，不同物種Cat D最適pH值均在2.5～4范圍內(nèi)，且對pH值的敏感性較強，一般在pH 5時活性就顯著降低；不同物種Cat D間最適pH值差異較大的原因可能有如下兩點：1）不同物種以及同一物種不同組織細胞來源Cat D的結構功能不同，其最適pH值存在差異。2）不同研究者用的底物不同，很可能是另一個主要原因[22-23]。Komai等[24]分別用酸變性血紅蛋白、酸變性酪蛋白和特異性熒光底物，測得太平洋褶魷魚Cat D的最適pH值分別為3.5、2.2和3.0，可見底物種類對判定最適pH值有較大影響。

關于Cat E的研究報道較少，Inokuchi等[10]發(fā)現(xiàn)牛蛙Cat E在pH 2.5顯示最大酶活力，而當pH值升至4時，酶活力降為35%，pH值升至5時，酶活性幾乎全部消失。Yasuda等[21]測得大鼠胃和人紅細胞Cat E的最適pH值為4，當pH值升到6時，酶活力降為最大酶活力的20%以下。

Cappiello等[25]發(fā)現(xiàn)重組pro-Cat E的最大反應速率在pH 4.0時，隨著pH值上升，反應速率下降，pH值升至5.0時，反應速率降為0；而活化形式的Cat E則在pH 3.5～4.5范圍內(nèi)反應速率均穩(wěn)定在最高水平，但pH值升至4.8時，反應速率降為最大反應速率的40%下，當pH值升至5.25時，反應速率降為零。同樣，Zaidi等[26]測得重組人Cat E在中性pH值時幾乎沒有活性。Zeleznik等[27]研究了重組人類Cat E的最適pH值也為4.0，當pH值高于4.0時，活性迅速下降，pH 6.0時殘余酶活力為50%，但在pH 6.0～8.0，酶活力則抑制維持在50%左右，pH 8.5時徹底失活。Yasuda等[21]關于人紅細胞Cat E的報道，也有相似的結果。Lapresle等[28]發(fā)現(xiàn)兔脾臟Cat E在pH 2.5呈現(xiàn)峰值，但當pH值升至5時，酶活性則降至峰值的5%左右。

大多數(shù)報道均顯示Cat D和Cat E的最適pH值在酸性范圍。Athauda等[29]發(fā)現(xiàn)Cat E的最適pH值雖然在酸性范圍，但其在中性pH值時仍可以保持一定活性，而且顯示出不同的酶解切割特異性。在pH 5.5及pH 3.0時，Cat E傾向于水解Phe-X、Tyr-T、Leu-X等肽鍵，而當pH值為中性時Cat E則選擇性地水解Glu13-Ala14肽鍵。當pH值為7.4時，Cat E則選擇性地水解Arg-X和Glu-X肽鍵，尤其對Arg-Arg鍵則更為優(yōu)先水解[30-31]。同樣，Cat D也有相似現(xiàn)象。

上述研究表明，Cat D和Cat E的酶活力對環(huán)境pH值很敏感，其酶活力在較為狹窄酸性pH值范圍內(nèi)才能發(fā)揮作用。由圖1可知，在中性及堿性范圍內(nèi)，Cat E酶活力具有一定的穩(wěn)定性。刺參受外界環(huán)境刺激發(fā)生自溶后，會相繼發(fā)生細胞及溶酶體破裂，釋放的Cat E和Cat D會在短時間內(nèi)水解刺參結構蛋白。但是，刺參體液pH值為中性偏堿性，兩者的pH值穩(wěn)定性差異表明，Cat E在中性及堿性環(huán)境下依然具有酶活力。因此，相對Cat D而言，Cat E對刺參自溶的貢獻可能更大。

2.2 Cat D和Cat E的最適溫度

由圖2可知，在溫度為40 ℃時，Cat E達到酶活力高峰，而Cat D在60 ℃左右酶活力達到峰值。當溫度升至70 ℃，Cat D的相對酶活力維持在65%左右，而Cat E的相對酶活力則降低至不到10%，表明Cat D具有較強的熱穩(wěn)定性，而Cat E對環(huán)境溫度的敏感性較高。

同樣，貽貝Cat D最適溫度也為60 ℃，溫度升至80 ℃時活性降至最大活性的60%左右[13]。鯉魚Cat D在43～55 ℃范圍內(nèi)活性可一直維持在峰值水平[14]。歐洲橫紋烏賊肝胰腺Cat D最適溫度為50 ℃，但酶活性隨著溫度高于50 ℃而迅速降低，在60 ℃和65 ℃時，活性分別為最大活性的55.1%和32%[17]。草魚腸道Cat D的最適溫度為37 ℃，在50 ℃孵育30 min后，活性降至最大活性的20%[15]；大西洋鯡魚Cat D的最適溫度也為37 ℃[20]。鴕鳥Cat D在45 ℃顯示出最大酶活力，但在70 ℃時，酶活力分別降至52%和36%[17]。莫桑比克羅非魚Cat D最適溫度為50 ℃，在此溫度下孵育10、60 min，活性損失20%、35%；但在60 ℃孵育10、60 min后，活性分別降低60%、90%[18]。大西洋鮭魚肌肉Cat D最適溫度也為50 ℃[19]。Yasuda等[22]發(fā)現(xiàn)人紅細胞Cat D和鼠胃Cat E均在45 ℃呈現(xiàn)最大酶活性。

圖2 Cat D和Cat E的最適溫度Fig.2 Optimum temperatures for Cat D and Cat E

2.3 Cat D和Cat E的熱穩(wěn)定性

溫度對Cat D和Cat E酶活力的影響如圖3所示。刺參體壁的Cat D和Cat E在溫度20～40 ℃時，酶活力較為穩(wěn)定，溫度超過50 ℃酶活力急劇下降，但Cat D下降的速度較Cat E略緩慢，證明了Cat D較Cat E具有較強的熱穩(wěn)定性。

與陸生動物比較，海洋動物體內(nèi)蛋白酶的熱敏性更高，更易失活。大西洋鱈魚Cat D的熱穩(wěn)定性很低，在40 ℃孵育15 min后，活性就全部消失，而牛Cat D在45 ℃酶活很穩(wěn)定，在60 ℃孵育15 min后，酶活力才明顯下降[16]。盡管歐洲橫紋烏賊肝胰腺Cat D在50 ℃呈現(xiàn)最大酶活力，但在50、55 ℃和60 ℃孵育30 min后，活性降至最大活性的75.2%、49%和20.5%，在65 ℃孵育30 min后活性已經(jīng)喪失[17]。馬鮫魚Cat D在50 ℃孵育20 min后活性降至初始值50%以下[32]。

大西洋鯡魚與牛Cat D在較高溫度具有相似的熱穩(wěn)定性，65 ℃孵育1 h后的活性幾乎沒有下降；而鮭魚Cat D在50 ℃孵育3 min后，活性幾乎全部喪失[20]。南極冰魚Cat D具有較強的熱穩(wěn)定性，在50 ℃孵育55 min后，其Cat D活性還能夠保持最大活性的50%，而人類Cat D在50 ℃半衰期只有3 min，虹鱒魚肝臟Cat D在50 ℃孵育不到2 min，酶活性就全部喪失[33]。

圖3 Cat D和Cat E的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stabilities of Cat D and Cat E

2.4 金屬離子對Cat D和Cat E的影響

圖4 金屬離子對Cat D和Cat E活力的影響Fig.4 Effects of metal ions on activities of Cat D and Cat E

金屬離子對Cat D和Cat E酶活力的影響如圖4所示，Ca2+、Mg2+對Cat D、Cat E活性的影響不大。Zn2+對Cat D的抑制作用較強，但不會抑制Cat E的活性。Fe2+能夠抑制Cat D和Cat E的活性，抑制率分別為29.2%和82.2%；Fe3+對Cat D和Cat E的抑制作用更強，抑制率分別為56.5%和99.1%，能夠完全抑制Cat E的活性。Cu2+、Mn2+均對Cat D有較強的抑制作用，對Cat E的抑制作用相對較弱。

金屬離子是影響蛋白酶活性的一個重要因素。一方面，金屬離子可能抑制蛋白酶的活力，其機制可能是：1）與蛋白酶活中心氨基酸上的基團（例如半胱氨酸的巰基）結合，從而抑制酶的活性；2）與蛋白酶非活性中心的氨基酸結合，影響蛋白酶空間構象，從而降低酶活力。相反，金屬離子還可能作為激活劑提高蛋白酶的活力，尤其是活性中心依賴金屬離子的金屬蛋白酶，金屬離子作為金屬蛋白酶的輔基，與氨基酸結合形成穩(wěn)定常數(shù)較高的配合物，從而提高蛋白酶的活力。

由圖4可知，Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和Mn2+分別對刺參Cat D或Cat E均有一定抑制作用，但抑制作用有明顯差異，提示這2 種天冬氨酸蛋白酶與上述離子的相互作用存在較大不同。

2.5 抑制劑和激活劑對Cat D和Cat E的影響

由圖5可知，所用的幾種蛋白酶抑制劑和激活劑對Cat D和Cat E的作用幾乎是一致的。Pep A、Z-LLL、PMSF、1,10-菲啰啉能夠抑制兩者活性，抑制率分別約為98%～99%、65%～78%、30%～35%、19%～23%。Pep A幾乎可完全抑制兩者的酶活力，證明兩者均為天冬氨酸蛋白酶。兼具絲氨酸蛋白酶和木瓜蛋白酶抑制作用的PMSF對兩者的抑制率為30%～35%，金屬離子螯合劑1,10-菲羅啉對兩者的抑制率為19%～23%，提示Cat D和Cat E的活性中心附近很可能有絲氨酸參與酶活性的調(diào)節(jié)，而且兩者有一定的金屬離子依賴性。同為金屬離子螯合劑的EDTA卻對兩者活性有一定促進作用，可分別將Cat D和Cat E的活力提高6.6%和7.9%。有較多報道顯示，EDTA對組織蛋白酶等酸性蛋白酶具有激活作用[34-35]。由此可以推測，EDTA對兩者酶活力的提升作用很可能遠大于其螯合金屬離子而發(fā)揮的酶活抑制作用。

圖5 蛋白酶抑制劑和激活劑對Cat D和Cat E活性的影響Fig.5 Effects of protease inhibitors and activators on Cat D and Cat E

具有較強還原能力和巰基激活能力的DTT和L-Cys對Cat D和Cat E均有激活作用，其中DTT將兩者活性均提高了31%，L-Cys分別將Cat D和Cat E活性提高了9.64%和7.58%。這提示Cat D和Cat E分子結構中帶有較多的半胱氨酸，這些半胱氨酸極易形成二硫鍵，DTT能夠打開二硫鍵，使巰基處于還原狀態(tài)，L-Cys能夠保護游離巰基不形成二硫鍵，從而對Cat D和Cat E活性起到一定的激活和保護作用。

Z-LLL是半胱氨酸蛋白酶Cat K的特異性抑制劑，對Cat D和Cat E的抑制率分別為78.15%和65.21%，提示Cat D和Cat E與Cat K酶活中心結構有較強的相似性。盡管E-64、抗痛素和碘乙酸均為半胱氨酸蛋白酶抑制劑，但對Cat D和Cat E的作用卻不一致，抗痛素對酶活力無明顯影響，而碘乙酸則表現(xiàn)出一定的激活效應，Cat D和Cat E的酶活力分別增加至112.52%和110.46%，這進一步提示Cat D和Cat E與其他組織蛋白酶具有較大差異。

上述結果提示Cat D和Cat E為具有一定金屬離子依賴性的天冬氨酸蛋白酶，其活性中心周圍可能有半胱氨酸和絲氨酸參與酶活力的調(diào)節(jié)。

2.6 Pep A對刺參自溶的影響

由圖6可知，新鮮刺參蛋白提取物中，以分子質量較大的蛋白質為主，分子質量集中在114～200 kDa范圍內(nèi)和44.3 kDa處。刺參自溶6 h后，200 kDa的大分子蛋白質發(fā)生降解。加入終濃度分別為0.2、0.4 mmol/L的Pep A后，該大分子蛋白的降解明顯受到抑制。

Pep A是天冬氨酸蛋白酶特異性抑制劑，它能夠抑制海參自溶過程中大分子蛋白的降解，說明Pep A通過抑制海參內(nèi)源性天冬氨酸蛋白酶實現(xiàn)自溶抑制作用。由此可以推測，天冬氨酸蛋白酶很有可能參與刺參自溶過程。研究發(fā)現(xiàn)，海參內(nèi)源性半胱氨酸蛋白酶和基質金屬蛋白酶均參與海參自溶[1,36]，但天冬氨酸蛋白酶是否參與自溶鮮見報道。Eakpetch等[37]在蝦肉中加入Pep A，發(fā)現(xiàn)南美白對蝦的自溶能夠明顯受到抑制，從而確認天冬氨酸蛋白酶是引起南美白對蝦自溶的主要蛋白酶。除了分布于動物胃腸中的胃蛋白酶，生物體細胞內(nèi)的天冬氨酸蛋白酶主要包括Cat D和Cat E。因此，本實驗所考察的刺參體壁天冬氨酸蛋白酶必然以Cat D和Cat E為主，由此可以推測Cat D和Cat E很有可能參與了刺參自溶。

圖6 Pep A對刺參自溶自溶過程蛋白降解的影響Fig.6 Effect of Pep A on protein degradation during autolysis of sea cucumber

3 結 論

刺參Cat D最適pH 5.0、最適溫度60 ℃，Cat E最適pH 4.0、最適溫度40 ℃，兩者在20～40 ℃酶活力較為穩(wěn)定。Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+可抑制Cat D的活性。Fe3+、Fe2+、Cu2+可抑制Cat E的活力，但同一金屬離子對兩者抑制程度不一致；Cat D和Cat E均為具有一定金屬離子依賴性的天冬氨酸蛋白酶，其活性中心周圍可能有半胱氨酸和絲氨酸參與酶活力的調(diào)節(jié)。Cat D和Cat E很有可能參與刺參自溶過程中蛋白質的降解。