杜 程，崔曉東，王轉花,2,*

（1.山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；2.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

槲皮素是人類膳食中常見的黃酮類化合物之一，屬于黃酮化合物中的黃酮醇。研究表明，槲皮素具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎癥、抗病毒、抗自由基以及保護血管等[1]。在植物中，槲皮素大多以其糖苷的形式存在，如蘆丁、異槲皮素等。在蕎麥，尤其是苦蕎麥（Fagopyrum tartaricum L. Gaerth）中含有豐富黃酮類化合物，其含量比普通蕎麥（F. esculentum Moench）高10～100 倍[2]。蘆丁是蕎麥中黃酮類化合物的主要存在形式，具有降低毛細血管脆性、保持及恢復毛細血管正常彈性等功能，可以輔助治療高血壓，糖尿病等疾病[3]。因此蕎麥也成為當下最受歡迎的保健食品研發(fā)的原材料。

蕎麥中存在高活性的蘆丁水解酶（rutin-hydrolyzing enzyme，RHE），也叫做蘆丁降解酶，該酶可將蘆丁脫去蕓香糖苷水解為槲皮素，然后在黃酮醇氧化酶等的作用下，被進一步降解[4]。RHE負責這一過程的起始反應，因此RHE調控蕎麥中蘆丁和槲皮素的含量以及二者的比例。目前，國內外不同的課題組已經從蕎麥中提取出RHE，并對其催化性質、底物特異性等進行了一定的研究。Yasuda等[5-6]首次從苦蕎籽粒中分離出兩種分子質量約為70 kDa的RHE同工酶，其最適pH值都在5.0左右，當以蘆丁為底物時，Km分別為0.13 mol/L和0.12 mol/L，后續(xù)研究發(fā)現體積分數20%的水溶性溶劑如乙醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）可提高RHE活性。Baumgertel等[7]從蕎麥莖稈中提取出分子質量分別為74.5、85.3 kDa黃酮醇3-O-β-異二糖苷酶（flavonol-3-O-βheterodisaccharide glycosidase，FHG）同工酶，其中FHGI的Km值為0.561 mmol/L（以蘆丁為底物），并對其底物的特異性進行研究。徐寶才等[8]研究發(fā)現RHE在20%乙醇溶液中活性最高。王改玲[9]從苦蕎籽粒中分離出RHE粗品，并證明是一種高活性天然β-糖苷酶，體積分數高于40%的乙醇溶液對其有明顯的抑制作用。陳芳霞[10]研究發(fā)現RHE在10%～40%的甲醇溶液中活性變化不明顯，50%的甲醇溶液使其活性降低。張玉瑋等[11]從苦蕎籽粒中分離出一種分子質量為66 kDa的RHE，并研究催化體系對酶活的影響，發(fā)現50%或更高體積分數的甲醇對RHE具有明顯抑制作用，并對其氨基酸序列進行了解析，但并未得到完整的氨基酸序列。唐宇等[12]也從野生金蕎麥籽粒中純化出60 kDa的RHE，最適pH值為5.0，最適溫度為40 ℃。本課題組之前從苦蕎麥籽粒中純化RHE，其最適反應體系為醋酸銨緩沖液（20 mmol/L，pH 5.0），20%乙醇溶液溶解底物蘆丁可保留RHE活性不被抑制，最適反應溫度為40 ℃，其最適的pH值為5.0，與唐宇[12]和Bourbouze[13]等純化的RHE最適pH值基本一致，銅離子對RHE有顯著抑制作用[14-15]。根據前期的文獻報道，從不同蕎麥品種中或不同的蕎麥部位獲得的RHE，其性質存在差異（尤其是分子質量），這可能都源于蕎麥中的RHE存在多種同工酶[16]。

在食品加工過程中，以蕎麥尤其是苦蕎麥為原料制備的食品存在一定的苦澀味，嚴重影響口感，降低了蕎麥的利用價值[17]。蘆丁被RHE水解產生的槲皮素是其苦澀味產生的主要原因[17]。因此，若將苦蕎麥中蘆丁水解酶基因（Fagopyrum tartaricum rutin-hydrolyzing enzyme gene，FtRHE）敲除，則有可能獲得無苦澀味的蕎麥，更加有利于蕎麥的利用及推廣。盡管國內外在RHE的性質、底物特異性等方面已經做了一定的研究，但是迄今為止還鮮見RHE的DNA序列的報道。目前，昆蟲細胞表達異源蛋白是生物化學、生物物理和結構研究中制備復雜植物蛋白和哺乳動物蛋白的主要方法之一[18-19]。該表達系統(tǒng)具有真核表達系統(tǒng)的傳統(tǒng)優(yōu)勢，兼具原核表達系統(tǒng)高效表達外源蛋白的能力，同時具備比較完善的翻譯后加工修飾等功能[20]，因此利用該系統(tǒng)表達的重組蛋白具有良好的可溶性，其生物學活性、免疫原性、結構與功能等與天然蛋白極其相近[21]。本研究在前期工作的基礎上，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）分析RHE的肽指紋圖譜（peptide mapping fingerprint，PMF），解析特征肽序列，并結合苦蕎麥籽粒轉錄組數據，得到FtRHE，之后利用序列分析軟件，對其結構特征進行預測，并利用昆蟲表達系統(tǒng)成功表達了該蛋白，證實獲得的基因為RHE基因。本研究將為深入研究RHE的生物學功能以及利用該酶進行黃酮類物質的生物轉化提供理論支持，并且也為培育高蘆丁含量且無苦澀味的蕎麥品種提供了候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎籽粒，云蕎1號，由云南農業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所提供，保存于4 ℃冰箱中。

蘆丁、槲皮素、DNA Marker S Plus 英國BBI Life Sciences公司；Protein mwMarker、Taq DNA聚合酶、TurboFect轉染試劑 美國Thermo公司；pGEM-T-Easy質粒 美國Promega公司；限制性內切酶BamHI、NotI加拿大Fermentas公司；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；HiPrepTM26/10脫鹽柱、HiTrap DEAE FF（5 mL）離子交換柱、SuperdexTMG75 10/300凝膠柱 美國GE公司；SIM SF昆蟲細胞培養(yǎng)基 中國Sino Biologica公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AKTATMExplore蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司；Gene Genius Bio Imaging System 美國Syngene公司；PAC200電泳儀 美國Bio-Rad公司；Mighty Small SE-245型電泳槽 瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司；立式高速冷凍離心機 日本三洋公司；酸度計德國WTW公司；3100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、Supersil ODS2柱 中國大連依利特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RHE的制備

天然RHE的制備參照實驗室之前建立的方法執(zhí)行[12-13]。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

用SDS-PAGE檢測經離子交換層析和分子排阻層析分離獲得的RHE。12.5%分離膠，4%濃縮膠，低分子質量蛋白為標準，用考馬斯亮藍R-250染色，確定RHE的分子質量及純度。電泳結果采用Gene Genius Bio Imaging System拍照進行分析。

1.3.3 MALDI-TOF MS鑒定天然RHE

用潔凈刀片從SDS-PAGE膠上切下RHE條帶，將膠條進一步切碎放入Eppendorf管中，每管加入300 μL 100 mmol/L NH4HCO3-30%乙腈脫色。冷凍干燥后，加入5 μL5 mg/mL測序級胰蛋白酶溶液，37 ℃反應過夜，20 h左右。吸出酶解液，轉移至新EP管中，原管加入100 μL 60%硝酸鈰銨-0.1%三氟乙酰丙酮，超聲15 min，合并前次溶液，凍干。加適量20%乙腈溶液復溶，取1 μL樣品，點于樣品靶上（384 Opti-TOF 123 mm×81 mm ss ABI），讓溶劑自然干燥，取0.5 μL過飽和CHCA基質溶液（溶劑為50%乙腈-0.1%三氟乙酰丙酮）點至對應靶位上并自然干燥，然后在4800 Plus MALDI-TOF MS進行分析。質譜條件激光源為355 nm波長的Nd:YAG激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據，PMF質量掃描范圍為800～4 000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進行二級質譜分析，每個樣品點上選擇8 個母離子，二級質譜激光激發(fā)2 500 次，碰撞能量2 kV，碰撞誘導解離關閉。質譜資料提交MASCOT搜索引擎進行分析（http://www.matrixscience.com）。

1.3.4 RHE基因克隆

在建立的蕎麥未成熟種子轉錄組數據庫中，利用關鍵詞β-glycosidase進行搜索，找出相關基因序列。結合MALDI-TOF MS鑒定的特征肽，與找出的相關基因翻譯的氨基酸序列進行比對，確定用于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增FtRHE的引物。上游序列為：5’-CAAAACCATGGCTACTTTTACATCA ATGT-3’，下游序列為5’-ACATTAGTCATGCATCCATG ACTGGATCT-3’，擴增條件為：94 ℃、3 min；94 ℃、1 min，57 ℃、30 s，72 ℃、2 min，共計30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測?；厥誔CR產物連接到pGEM-T-Easy載體，挑取單克隆培養(yǎng)后進行測序。

1.3.5 RHE結構序列分析

在測序結果中，尋找開放閱讀框。然后采用NCBI在線比對（BLAST）（http://blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi），對FtRHE基因編碼的蛋白序列及其蛋白數據庫進行比對并下載同源性較高的序列；通過Signal P（http://www.cbs.dtu.dk/sercices/SignalP/）進行信號肽預測。應用ClustalW程序（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）進行氨基酸的多重序列比對。

1.3.6 RHE在昆蟲系統(tǒng)的表達

以含有FtRHE基因的pGEM-T-FtRHE為模板，引物GGATCCATGTCGTACTACCATCACCATCACCATC ACGATTACGATATCCCAACGACCATGGCTACTTT TACATCAATGTCCTTCA和ACATTAGGCGGCCGCT CATTATGCATCCATGACTGGATCT進行PCR擴增。擴增得到的PCR產物與pGEM-T載體連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經藍白斑篩選，酶切，測序驗證后，保存菌種。將保存的菌種擴大培養(yǎng)后提取質粒，質粒經BamHI和NotI酶切后與同樣經BamHI和NotI酶切后的pFastBac Dual載體相連。將重組的pFastBac Dual-FtRHE（測序驗證正確）質粒轉化感受態(tài)DH10Bac，涂板于含卡那霉素（kanamycin，Kana）/慶大霉素（gentamicin，Gen）/四環(huán)素（tetracyclines，Tet）的固體培養(yǎng)基，采用藍白斑篩選法挑取含有重組Bacmid的白色菌落。搖菌擴大培養(yǎng)后，離心收集菌體，采用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒。用Invitrogen Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)技術手冊推薦的引物PUCf正向引物5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’和PUCr反向引物5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’對重組的Bacmid進行PCR驗證。選取白色菌落再次涂布于新的Tet/Gen/Kana/LB/X-Gal/IPTG平板上繼續(xù)培養(yǎng)，如此篩選3 代依然為白色菌落的可視為轉座完全。將含有重組克隆的菌液離心得到菌體沉淀，采用質粒抽提試劑盒提取桿粒，經PCR驗證等確認重組桿粒中含有目的基因FtRHE。

提取桿粒轉染昆蟲細胞Sf9，生產重組桿狀病毒。首先轉染Sf9細胞處于對數期（2×106個/mL），且存活率高于95%，每孔中（6 孔板）加入1 mL細胞，在28 ℃過夜培養(yǎng)，使細胞完全貼壁。取8 μL TurboFect轉染試劑稀釋于100 μL不含抗生素的昆蟲培養(yǎng)基中，短暫渦旋混勻。取1 μg桿狀病毒DNA稀釋于100 μL不含抗生素的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。將稀釋后的DNA與稀釋的TurboFect轉染試劑混合，輕輕混勻并在室溫下孵育20 min。逐滴加上述DNA-脂質體混合物到已貼壁的細胞中。28 ℃孵育細胞4～5 h后加入600 μL昆蟲培養(yǎng)基。28 ℃孵育細胞72 h，直至觀察到綠色熒光（pFast Bac Dual載體由本實驗室插入一個EGFP熒光基因）。1 000×g離心，去除細胞碎片等，收集上清液，即為第1代病毒P1。用P1病毒，繼續(xù)感染Sf9細胞，制備P2及P3病毒儲液。確定P3病毒滴度后，進一步感染Sf9細胞，大概48～72 h后收集上清液，得到含有重組RHE的蛋白粗品[22]。

1.3.7 重組RHE的純化

收集P3病毒感染Sf9細胞后的上清液，1 000×g離心去除細胞碎片等，得到重組蕎麥RHE粗品。按照每4 mL上清液加200 μL 50% Ni-NTA的比例加入Ni-NTA，200 r/min振蕩1 h；靜置除去上清液，再加入清洗緩沖液，溫柔混勻清洗緩沖液和Ni-NTA，靜置棄去上清液，重復上述步驟2次；加入100 μL的洗脫緩沖液，溫柔混勻洗脫緩沖液和Ni-NTA，收集上清液，重復上述步驟2 次，合并3 次得到的上清液，得到純化的重組RHE。收集洗脫峰，SDS-PAGE分析。得到的蛋白經脫鹽處理后，冷凍干燥，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｇ逑淳彌_液為：20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 7.6。洗脫緩沖液為：20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.6[23]。

1.3.8 重組RHE活性鑒定

為檢測重組RHE是否具有活性，采用其天然底物蘆丁，在下述反應體系中進行活性測定：醋酸銨緩沖液（20 mmol/L，pH 5.0）700 μL，加入蘆丁溶液200 μL（10 mg/mL，溶于乙醇溶液）和純化RHE 100 μL（100 μg/mL），空白對照加100 μL水，在37 ℃水浴保溫30 min，反應體系顏色加深，有沉淀析出。12 000 r/min離心收集沉淀，甲醇溶解沉淀。將反應后上清液及溶解后沉淀分別通過HPLC分析。HPLC流動相為甲醇-0.4%磷酸（1∶1，V/V），流速1 mL/min，檢測波長254 nm[24-25]。采用雙倒數作圖法測定RHE的Km值。分別在1.6、3.2、4.8、6.4、8.0 mmol/L和9.6 mmol/L的底物濃度條件下（底物溶于80 mmol/L、pH 5.0的醋酸銨緩沖液，20%甲醇）測定天然及重組RHE的活性，每測定設置3 次重復[11]。

1.4 數據處理及圖像處理

采用Origin Pro 8.5、Microsoft Office Excel 2003、Photoshop進行數據處理。采用Photoshop對蛋白膠以及核酸膠圖進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 天然RHE制備

圖1 天然RHE的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of RHE

RHE在蕎麥中存在多種同工酶[16]，從不同種質的蕎麥得到的RHE在分子質量大小、催化性質等方面也不同。因此，本研究在天然RHE制備、轉錄組分析、RNA提取、RHE基因克隆等實驗，均采用云蕎1號苦蕎進行實驗。按照之前建立的純化方法，成功純化了該蛋白，SDS-PAGE分析顯示，分子質量約為62 kDa（圖1）。純化的天然RHE與唐宇等[12]從野生金蕎麥籽粒中純化的RHE分子質量相當。經活性測定，純化的蛋白可以將天然底物蘆丁脫去蕓香糖苷，轉化為槲皮素，轉化率達到95%以上。表明純化的蛋白具有RHE活性，可以用來進行后續(xù)的分析鑒定實驗。

2.2 RHE的鑒定

純化的天然RHE，經SDS-PAGE分離后，考馬斯亮藍染色，20%乙醇溶液完全脫色后，切下條帶，然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行MALDI-TOF MS分析，得到其肽指紋圖譜。經在線軟件MASCOT分析比對，RHE屬于一種β-葡萄糖苷酶。PMF質荷比為914.428 6肽段獲得的內肽序列為FSISWSR，這一肽段在很多的糖苷酶中均被發(fā)現，說明該肽段在糖苷酶中都非常保守。此外，質荷比為2 712.133 1的肽段ALDFMFGWFANPITFGDYPESMR被鑒定與大豆中氰苷水解酶（gi/356557126）的序列一致。質荷比為1 751.715 7的肽段IANGTTGDVADDFYHR被鑒定為與菠蘿中β-葡萄糖苷酶（OAY80832.1）序列一致[26]。這些鑒定結果表明，RHE為一種β-葡萄糖苷酶。

2.3 FtRHE基因的克隆

在云蕎1號幼嫩種子的轉錄組數據庫中用β-glucosidase搜索得到DNA序列，找到開放閱讀框。將DNA序列翻譯為氨基酸序列，將翻譯得到的氨基酸序列與MALDI-TOF MS鑒定的多肽序列進行比對，確定對應的DNA序列，并以此序列為模版設計引物，擴增FtRHE基因。經PCR擴增，獲得了分子質量約為1 600 bp的條帶（圖2），并將該條帶回收，與pGEM-T-Easy載體連接，經測序確定其基因序列。結果顯示，該基因開放閱讀框由1 539 bp堿基組成，編碼512 個氨基酸，預測的分子質量約為57.88 kDa。該基因已在GenBank數據庫登錄，登錄號為2055990。

圖2 FtRHE基因的PCR擴增電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplif i ed products of FtRHE gene

2.4 FtRHE序列分析

利用NCBI的BLASTP程序進行蛋白質保守區(qū)預測表明，FtRHE編碼的RHE屬于Glyco_hydro_1 superfamily成員（糖苷水解酶家族1成員，圖3A）。這一結果與肽質量指紋圖譜鑒定的結果一致。軟件SignalP 4.1預測結果顯示，FtRHE基因編碼的蛋白N端存在信號肽編碼區(qū)，1～25位氨基酸的平均信號肽得分為0.811，高于0.45閾值，表明1～25位氨基酸可能為其信號肽（圖3B）。同時預測結果也顯示29位天冬氨酸和30位蘇氨酸的之間的斷裂位點得分也較高，也是潛在的信號肽斷裂位點（圖3B）。信號肽后TLTRNSFPEGFVFGAGS序列文獻報道的RHE的N端序列TVSRSSFPDGFLFGL同源性更高[11]，因此1～29位氨基酸更有可能為其信號肽。將苦蕎麥中的RHE與GenBank中選取的其他物種來源，且功能明確的β-葡萄糖苷酶，用Clustal W對其進行多重序列比對，發(fā)現該基因在各物種間的保守性不是特別高，相似性普遍集中在54%～62%之間。如圖4所示，不同來源的β-葡萄糖苷酶其信號肽序列保守性都比較差，其他氨基酸序列的保守性相對較高。多肽序列FSISWSR在不同來源的β-葡萄糖苷酶序列都完全一致。經MALDITOF MS鑒定的ALDFMFGWFANPITFGDYPESMR和IANGTTGDVADDFYHR在不同來源的β-葡萄糖苷酶中序列保守性也較高。但是這兩個肽段在FtRHE基因編碼的氨基酸序列中也不完全一致，可能是蕎麥中存在多種同工酶所致。

圖3 RHE保守結構域及信號肽分析Fig.3 Conservative structure domain and signal peptide analysis of RHE

圖4 RHE與其他植物來源β-糖苷酶多重序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment analysis of RHE and β-glycosidases from other plants

2.5 FtRHE基因在昆蟲系統(tǒng)中的表達

圖5 重組桿粒Bacmid-FtRHE構建Fig.5 Construction of recombination bar-Bacmid-FtRHE

為驗證獲得的FtRHE基因編碼的蛋白是否具有RHE活性，構建昆蟲表達系統(tǒng)，獲得重組RHE。圖5A、B為構建的pFastBac Dual-FtRHE酶切驗證，將驗證正確的質粒轉化感受態(tài)DH10Bac，轉座得到含有FtRHE的Bacmid質粒（圖5C），用Invitrogen Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)推薦的引物PCR驗證正確。P3病毒感染培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)的Sf9細胞后，離心收集上清液，獲得重組RHE粗品。SDS-PAGE結果顯示，重組RHE主要存在于P3代感染細胞后的上清液中，而裂解的Sf9細胞中基本未見重組RHE的表達，說明重組RHE的主要以分泌形式在胞外表達（圖6A）。經Ni-NTA純化后，獲得了純的重組RHE，SDS-PAGE分析結果顯示，rRHE的分子質量約為66 kDa（圖6B），比其理論值稍大，可能是昆蟲表達系統(tǒng)產生的重組RHE與天然RHE一樣存在糖基化修飾所致[27-28]。

圖6 重組RHE的表達與純化Fig.6 Expression and purif i cation of recombinant RHE

2.6 重組RHE活性測定結果

按照先前確定的反應體系及反應條件進行重組RHE活性測定。在37 ℃水浴反應30 min后，反應體系顏色加深，有黃色小顆粒物析出。說明重組RHE將蘆丁水解產生不溶于稀醇（20%乙醇溶液）的槲皮素。離心收集沉淀，重新溶解于乙醇溶液，進行HPLC分析。從圖7A可見，蘆丁和槲皮素標準品保留時間分別為7.206 min和17.005 min，而圖7B、C中的保留時間表明，重組RHE可以將蘆丁特異性地水解為槲皮素。測定重組RHE在不同底物濃度條件下的反應速率，根據Lineweaver-Burk雙倒數作圖法計算其Km為0.49 mmol/L，同時測定天然RHE的Km為0.74 mmol/L。酶學活性測定結果表明，FtRHE基因編碼的蛋白確實具有RHE活性，FtRHE即為苦蕎麥中RHE的同源基因之一。

圖7 HPLC鑒定RHE水解產物Fig.7 Identif i cation of rutin hydrolysate by HPLC

3 討 論

以云蕎1號苦蕎種子為材料，成功獲得了苦蕎麥中RHE基因FtRHE。FtRHE的開放閱讀框由1 539 bp組成，編碼512 個氨基酸，屬于一種β-葡萄糖苷酶，重組的蛋白可以特異水解蘆丁為槲皮素。在之前的研究中也發(fā)現，天然RHE不僅僅具有RHE活性，同時還是一種甘露糖結合凝集素，對人O型血紅細胞具有特異性凝集作用，因此也曾把RHE命名為苦蕎麥凝集素（tartary buckwheat lectin，TBL）[29]。同時TBL具有N-糖苷酶活性，對結直腸癌具細胞具有特異的抑制作用，其機制可能為通過調控microRNA的表達進而抑制細胞增殖[30]。TBL（天然RHE）存在糖基化修飾，根據硫酸-苯酚法，測得TBL含糖量為5.8%，即TBL或天然RHE去除糖鏈后的分子質量約為58.4 kDa（62 kDa×（1-5.8%）），這一結果與本研究中由FtRHE基因預測的分子質量（57.88 kDa）基本相符。但是研究還不清楚糖基化修飾是否對RHE發(fā)揮水解蘆丁活性有影響，為得到具有糖基化修飾的重組RHE，本研究采用昆蟲表達系統(tǒng)來表達重組RHE，得到了與天然RHE性質相似且具有蘆丁水解活性的重組RHE，最終確定獲得的FtRHE基因即為蕎麥中RHE基因。重組RHE的Km值為0.49 mmol/L，這與已報道的RHE Km都很接近，但分子質量大小差別較大，很可能是由于存在多種RHE的同工酶。如Cui Xiaodong等[14]從Shouyang苦蕎種子中純化得到的70 kDa的RHE的Km值為1.03 mmol/L；Baumgertel等[7]從蕎麥莖稈中提取的74.5 kDa的黃酮醇3-O-β-異二糖苷酶，當以蘆丁為底物時，Km值0.561 mmol/L；張玉瑋等[11]從苦蕎籽粒中純化得到的66 kDa的RHE，其Km為0.27 mmol/L。因此，RHE基因的獲得將為高蘆丁含量蕎麥無苦澀味蕎麥的育種提供候選基因。同時，通過基因工程的方法獲得重組RHE，也可為酶法水解蘆丁制備槲皮素的提供特異性酶。