劉國(guó)榮，李 雪，王成濤*

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048）

乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過程中通過核糖體機(jī)制合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，它在人體內(nèi)可被降解，具有高效、無抗藥性、無毒、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，已成為益生菌生物活性代謝產(chǎn)物研究與開發(fā)的熱點(diǎn)[1]。

對(duì)乳酸菌細(xì)菌素抑菌作用機(jī)制的研究是評(píng)價(jià)其在食品中應(yīng)用安全性的重要依據(jù)之一。目前已有報(bào)道從抑菌作用方式和敏感菌細(xì)胞膜通透性等方面開展了乳酸菌細(xì)菌素抑菌機(jī)理研究[2-3]，已基本明確細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽性（G+）細(xì)菌的主要作用機(jī)制是改變敏感菌細(xì)胞膜通透性，釋放胞內(nèi)離子及紫外吸收物質(zhì)，耗散質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)，干擾膜運(yùn)輸，最終引起細(xì)胞死亡。但是隨著研究的深入，部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素對(duì)敏感菌的抑菌作用還與其細(xì)胞內(nèi)能量代謝及糖類轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等部分相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。如Bendali等[4]通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌素處理后李斯特菌細(xì)胞內(nèi)少數(shù)蛋白表達(dá)量明顯下降，但未對(duì)這些蛋白進(jìn)行鑒定，對(duì)造成這種現(xiàn)象的原因也未給出合理解釋；Ramnath等[5]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌素mesentericin Y105對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌的抑制作用與受體細(xì)胞中甘露糖特定磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)有關(guān)。鑒于此，有必要從蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步探究乳酸菌細(xì)菌素的抑菌作用機(jī)理。

從研究對(duì)象看，目前細(xì)菌素抑菌機(jī)制的研究主要圍繞G+細(xì)菌展開，如單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌，而對(duì)革蘭氏陰性（G-）細(xì)菌的抑菌機(jī)制研究報(bào)道極少。這是由于多數(shù)乳酸菌細(xì)菌素僅對(duì)近緣的G+細(xì)菌有抑菌活性，而只有少數(shù)細(xì)菌素報(bào)道可抑制G-細(xì)菌的生長(zhǎng)。目前已報(bào)道的可以同時(shí)抑制G+和G-細(xì)菌生長(zhǎng)的細(xì)菌素有plantaricin ST31[6]、bacteriocin AMA-K[7]、plantaricin MG[8]、sakacin C2[9]、ent35-MccV[10]、lactocin MXJ 32A[11]以及bif i docin A[12]。探究這些廣譜細(xì)菌素對(duì)G-細(xì)菌的抑菌作用機(jī)制對(duì)于乳酸菌細(xì)菌素的開發(fā)和利用具有重要科學(xué)意義[13]。

動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）BB04分離自中國(guó)新疆于田長(zhǎng)壽老人腸道，是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道的產(chǎn)細(xì)菌素動(dòng)物雙歧桿菌，可代謝合成新型雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A，該細(xì)菌素對(duì)多株食源性G+和G-病原菌均表現(xiàn)抑菌活性，且食品加工適應(yīng)性好，有作為天然食品生物防腐劑的巨大應(yīng)用潛力，前期課題組已對(duì)該細(xì)菌素的分子結(jié)構(gòu)、特性及合成條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究[12,14]，并從抑菌作用方式、敏感菌細(xì)胞膜通透性及細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性角度對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行探索[15-17]。為進(jìn)一步從蛋白表達(dá)水平探討該細(xì)菌素對(duì)G-菌的抑菌作用機(jī)理，本研究采用雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）聯(lián)合蛋白質(zhì)基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser analytical ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)分析細(xì)菌素bifidocin A處理前后G-大腸桿菌1.90細(xì)胞總蛋白表達(dá)差異情況，并在基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋基礎(chǔ)上，對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能分類及富集分析。研究結(jié)果對(duì)于全面解析乳酸菌細(xì)菌素的抑菌機(jī)制具有重要科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種及培養(yǎng)基：細(xì)菌素bifidocin A純品（質(zhì)量濃度為1.85 mg/mL，純度為95.3%），產(chǎn)生菌為動(dòng)物雙歧桿菌（B. animalis）BB04，由本實(shí)驗(yàn)室自主分離提取純化[12-16]；敏感菌：大腸桿菌（Escherichia coli）CGMCC1.90 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；LB培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

IPG膠條（pH 3～10，24 cm）、SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒 美國(guó)Bio-Rad公司；RNA提取試劑盒、尿素、硫脲、二硫蘇糖醇、Tris-HCl（pH 8.8）緩沖液、過硫酸銨、礦物油 北京半夏科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XO超聲波細(xì)胞破碎儀 南京先歐儀器制造有限公司；QL-901旋渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PROTEAN IEF Cell等電點(diǎn)聚焦儀、Illumina Eco?實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x 美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀、Image Scanner掃描儀 美國(guó)GE公司；4800 Plus MALDI TOF MS儀美國(guó)AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 敏感菌培養(yǎng)及細(xì)菌素bif i docin A處理菌懸液的制備[14]

收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌1.90菌體細(xì)胞，用0.1 mol/L（pH 7.0）的羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）緩沖液反復(fù)洗滌3 次后，重懸于0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液中，制備成106CFU/mL菌懸液，并向其中加入適量細(xì)菌素bif i docin A純品溶液，使最終作用濃度為最低抑菌濃度水平（0.019 mg/mL），37 ℃溫育處理2 h。以未添加細(xì)菌素的大腸桿菌菌懸液作為對(duì)照。

1.3.2 敏感菌細(xì)胞總蛋白提取

取20 mL細(xì)菌素處理前后的大腸桿菌菌懸液，4 ℃、10 000 r/min離心10 min去除上清液，用1～2 mL的溶解緩沖液（7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，4% 3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，1%蛋白酶抑制劑）將菌體細(xì)胞重懸，反復(fù)凍融3 次，在冰上超聲15 min。4 ℃、12 000 r/min離心30 min去除沒有破碎的細(xì)菌。通過Bradford法測(cè)定蛋白濃度，并在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 2-DE

1.3.3.1 第1向固相pH梯度等電聚焦電泳（isoelectric focusing，IEF）

將500 μg敏感菌總蛋白提取物溶解在水化液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% 3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，20 mmol/L二硫蘇糖醇，65 mmol/L Tris，0.2% Bio-Lyte(3-10)，1%溴酚藍(lán)）中，使終體積為250 μL。充分混合后將其加入到IPG膠條（pH 3～10，24 cm）內(nèi)溶脹12 h，然后將IPG膠條放入IEF儀，膠條上滴加一定量的礦物油。按以下參數(shù)和程序完成IEF：500 V，1 h；1 000 V，1h；8 000V，4 h；2 000 V，10 h；500 V維持（每膠條電流50 mA）。

1.3.3.2 第2向垂直板SDS-PAGE

將IEF完畢后的IPG膠條分別在平衡緩沖液I（6 mol/L尿素、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、20%甘油、2% SDS、1%二硫蘇糖醇）和平衡緩沖液II（6 mol/L尿素、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、20%甘油、2% SDS、2.5%碘乙酰胺）中各平衡15 min；將IPG膠條轉(zhuǎn)移到SDSPAGE上，用低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液封閉。凝固后進(jìn)行SDSPAGE，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%，濃縮膠按15 mA、分離膠按30 mA進(jìn)行電泳，至指示線到達(dá)膠底部。

1.3.4 凝膠染色及圖像采集分析

SDS膠用考馬斯亮藍(lán)G250染色2 h，脫色過夜。圖像采集使用Image Scanner掃描儀掃描凝膠。獲取圖像后，使用PD Quest 8.0對(duì)比分析掃描獲得的凝膠圖像，進(jìn)行蛋白點(diǎn)的辨識(shí)以及匹配，比對(duì)蛋白豐度，尋找差異蛋白點(diǎn)并進(jìn)行編號(hào)。

1.3.5 差異蛋白MALDI-TOF MS鑒定

從凝膠中切下差異倍數(shù)在1.5 倍以上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，測(cè)定前用胰蛋白酶水解樣品。并將所得肽段信息通過Mascot檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。

1.3.6 差異蛋白qRT-PCR分析

為了進(jìn)一步了解差異表達(dá)蛋白對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)模式，并評(píng)價(jià)其mRNA水平與蛋白質(zhì)水平上表達(dá)相關(guān)性，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)質(zhì)譜鑒定出的10 個(gè)目標(biāo)差異蛋白進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平分析。PCR引物根據(jù)NCBI提供的序列，采用Primer 3在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，具體信息見表1；選擇編碼大腸桿菌3-磷酸甘油醛脫氫酶gapA作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析采用2－ΔΔCt（Livak）法[18]。

表1 qRT-PCR所用引物Table1 Primers used in qRT-PCR

1.3.7 差異蛋白GO注釋分析

檢索GO數(shù)據(jù)庫的GO號(hào)，基于序列相似性，通過BLAST找到與實(shí)驗(yàn)結(jié)果序列相似的模式生物蛋白，分別從細(xì)胞組成、生物過程和分子功能3 個(gè)方面，對(duì)差異蛋白質(zhì)在功能方面進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 敏感菌細(xì)胞總蛋白2-DE結(jié)果

經(jīng)蛋白定量，大腸桿菌1.90細(xì)胞總蛋白樣品的電泳上樣量為1.16 mg/mL。細(xì)菌素bifidocin A處理前后大腸桿菌細(xì)胞總蛋白的2-DE圖譜如圖1所示，結(jié)果顯示，未經(jīng)細(xì)菌素處理的細(xì)胞總蛋白2-DE圖譜中共分離到171 個(gè)蛋白點(diǎn)，而經(jīng)細(xì)菌素處理后細(xì)胞總蛋白樣品共分離到194 個(gè)蛋白點(diǎn)，這些蛋白點(diǎn)分子質(zhì)量分布在10.23～96.67 kDa之間，等電點(diǎn)介于3.45～8.83之間；從等電點(diǎn)（pI）分布來看，大多數(shù)蛋白質(zhì)集中在pI 6.0～8.0之間，其中在pI 3.0～5.0、5.0～6.0和6.0～8.0之間分別有79、51 個(gè)和23 個(gè)蛋白點(diǎn)；從分子質(zhì)量分布來看，大部分蛋白點(diǎn)分布在110～30 kDa之間，110～80、80～50 kDa及30～50 kDa的蛋白點(diǎn)分別有25、109 個(gè)及23 個(gè)。以上結(jié)果都說明，細(xì)菌素處理前后大腸桿菌細(xì)胞總蛋白樣品經(jīng)2-DE得到了有效分離。

圖1 細(xì)菌素bi fi docin A處理前（A）、后（B）大腸桿菌1.90細(xì)胞總蛋白的2-DE圖譜Fig.1 2-DE pro fi les of whole proteins extracted from untreated E. coli 1.90 cells (A) and cells treated with bi fi docin A (B)

2.2 敏感菌細(xì)胞總蛋白匹配分析

圖2 敏感菌細(xì)胞差異蛋白點(diǎn)2-DE圖Fig.2 2-DE images of differentially expressed protein spots from cells treated with bif i docin A

使用PD Quest8.0軟件對(duì)不同處理樣品的凝膠圖像進(jìn)行匹配分析，選取蛋白豐度差異倍數(shù)在1.5 倍以上的差異蛋白點(diǎn)，結(jié)果見圖2所示。經(jīng)細(xì)菌素處理后大腸桿菌細(xì)胞總蛋白表達(dá)豐度存在一定差異，共篩選獲得12 個(gè)差異蛋白點(diǎn)（圖3）。將上述差異蛋白點(diǎn)通過Quantity Table Reports軟件導(dǎo)出需要的差異蛋白點(diǎn)定量信息，以處理組與對(duì)照組樣品中相應(yīng)蛋白分子質(zhì)量的比值為灰度值，當(dāng)灰度值大于1時(shí)，認(rèn)為該蛋白的表達(dá)發(fā)生了明顯的上調(diào)；當(dāng)灰度值小于1時(shí)，認(rèn)為該蛋白的表達(dá)發(fā)生了明顯的下調(diào)。結(jié)果表明，細(xì)菌素作用后大腸桿菌1.90細(xì)胞總蛋白中有10 個(gè)明顯下調(diào)蛋白點(diǎn)（9001、3102、7001、1702、3506、7605、2706、7301、1604、2608），2 個(gè)明顯上調(diào)蛋白點(diǎn)（6203、3205）。

圖3 bif i docin A處理前后大腸桿菌差異蛋白點(diǎn)局部放大圖Fig.3 Close-up of differentially expressed protein spots from E. coli cells untreated and treated with bif i docin A

2.3 差異蛋白質(zhì)譜鑒定及分析

對(duì)12 個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF MS分析與鑒定，結(jié)果如表2所示。置信區(qū)間能達(dá)到99%以上的蛋白點(diǎn)有10 個(gè)（除3102和3506外），說明這10 個(gè)點(diǎn)的測(cè)序和鑒定結(jié)果比較可靠。其中，2 個(gè)表達(dá)上調(diào)蛋白分別為外膜蛋白OmpA和外膜蛋白OmpW；8 個(gè)表達(dá)下調(diào)蛋白分別為抗酸分子伴侶蛋白HdeA、烷基氫過氧化物還原酶亞基、DNA復(fù)制蛋白PriB、分子伴侶蛋白DnaK、延胡索酸還原酶、依賴DNA的RNA聚合酶亞基、肌苷單磷酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶。

表2 MALDI-TOF MS鑒定的差異表達(dá)蛋白Table2 Differentially expressed proteins identi fi ed by MALDI-TOF MS

2.4 差異表達(dá)蛋白qRT-PCR分析

為了驗(yàn)證2-DE差異蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果，對(duì)10 個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖4所示，可以看出這些基因的表達(dá)水平變化與蛋白表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)趨勢(shì)一致，但差異表達(dá)倍數(shù)略微不同。這些結(jié)果說明，差異表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)水平變化基本一致。

圖4 差異表達(dá)蛋白的qRT-PCR分析Fig.4 qRT-PCR assay of differentially expressed proteins

2.5 差異表達(dá)蛋白的GO功能注釋

圖5 差異表達(dá)蛋白的GO功能分類統(tǒng)計(jì)Fig.5 Gene ontology prof i les of differentially expressed proteins

如圖5所示，涉及細(xì)胞組成的有2 個(gè)蛋白，分別為外膜蛋白OmpA和外膜蛋白OmpW，它們都與維持細(xì)胞膜形態(tài)和結(jié)構(gòu)有關(guān)[19-21]，這與之前本課題組從細(xì)胞水平揭示的細(xì)菌素抑菌機(jī)理一致，細(xì)菌素作用的主要部位是在敏感菌細(xì)胞膜上[14]。涉及生物過程有7 個(gè)蛋白，分別為抗酸分子伴侶蛋白HdeA、烷基氫過氧化物還原酶AhpR、DNA復(fù)制蛋白PriB、分子伴侶DnaK、延胡索酸還原酶、肌苷單磷酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶，其中，延胡索酸還原酶和琥珀酸脫氫酶參與三羧酸循環(huán)中延胡索酸和琥珀酸之間的轉(zhuǎn)化[22-23]，肌苷單磷酸脫氫酶是核苷酸合成途徑的關(guān)鍵酶[24]，細(xì)菌素處理后這3 個(gè)蛋白的表達(dá)量都降低，說明細(xì)菌素可能一定程度阻斷了敏感菌細(xì)胞的三羧酸循環(huán)，減少三磷酸腺苷合成前體，從而降低能量提供，這與之前從細(xì)胞膜通透性角度揭示的細(xì)菌素抑菌機(jī)理一致，細(xì)菌素處理后敏感菌胞內(nèi)能量代謝受到影響，三磷酸腺苷含量明顯下降[14]；抗酸分子伴侶蛋白HdeA、烷基氫過氧化物還原酶AhpR和分子伴侶DnaK都是作為全局脅迫調(diào)節(jié)子適應(yīng)脅迫條件的蛋白質(zhì)[25-28]，細(xì)菌素處理后這些蛋白表達(dá)量的降低，說明細(xì)菌素處理后細(xì)胞對(duì)外界脅迫條件的抵抗能力下降；DNA復(fù)制相關(guān)蛋白PriB，是大腸桿菌中參與DNA復(fù)制重啟反應(yīng)的相關(guān)蛋白[29-30]，其表達(dá)量下降說明細(xì)菌素可能對(duì)敏感菌DNA復(fù)制功能有影響。涉及細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄過程的有1 個(gè)蛋白，為依賴DNA的RNA聚合酶。

3 結(jié) 論

本研究采用2-DE聯(lián)合蛋白質(zhì)MALDI-TOF MS技術(shù)分析細(xì)菌素bif i docin A處理前后G-大腸桿菌1.90細(xì)胞總蛋白表達(dá)差異情況，并對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能分類及富集分析，旨在從蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步探討該細(xì)菌素對(duì)G-菌的抑菌作用機(jī)理。研究結(jié)果顯示細(xì)菌素bif i docin A可能是通過改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、阻斷三羧酸循環(huán)、減少能量及ATP提供以及降低細(xì)胞對(duì)外界脅迫條件的抵抗能力等來達(dá)到對(duì)敏感G-菌的抑菌效果。但是，細(xì)菌素對(duì)差異表達(dá)蛋白的具體作用機(jī)制以及差異表達(dá)蛋白之間的相互關(guān)系仍然不明確，未來需要進(jìn)一步探索研究。