寧 越，吳 森，張 樂，昝林森,2

(1 西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

秦川牛是我國著名的地方黃牛品種，具有耐粗飼、抗逆性(病)強、肉質(zhì)優(yōu)的特點，但生長慢、產(chǎn)肉量低且脂肪沉積欠佳[1]。我國地方黃牛資源豐富，西北農(nóng)林科技大學牛業(yè)團隊一直致力于秦川牛肉用性狀選育工作，利用常規(guī)育種手段及現(xiàn)代分子生物學技術，歷經(jīng)20余年，已成功選育出秦川牛肉用新品系，其生長速度、產(chǎn)肉性能均較秦川牛有顯著提高。

IRX3基因是Iroquois同源盒基因家族的成員之一，具有較高的保守性，是調(diào)節(jié)脊索動物脂肪沉積的重要基因[2-3]。該家族的各成員在脊椎動物胚胎形成過程中參與許多調(diào)控作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，IRX3是調(diào)控脂肪組織的重要因子，并對脂肪沉積有重要影響[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，敲除斑馬魚IRX3a基因后，胰腺饑餓素ε細胞(pancreatic ghrelin-producing epsilon cells)數(shù)量上升，胰島素β細胞數(shù)量下降(insulin-producing beta-cells)，胰高血糖素α細胞(glucagon-producing alpha-cells)數(shù)量上升，表明胰腺中IRX3基因的功能與肥胖和Ⅱ型糖尿病有直接關聯(lián)[6-9]。另外，人們原來一直認為人類肥胖在遺傳上主要是由于FTO基因突變導致的，但實際上是由FTO基因內(nèi)部的一些肥胖相關元件與位于基因組上較遠位置的IRX3基因發(fā)生互作而導致的，因此IRX3很可能是一個具有肥胖功能的基因[10-12]。而FTO基因自身似乎只對肥胖產(chǎn)生周邊效應[13-15]。

目前，有關IRX3基因的研究仍然較少，在非模式動物上的研究幾乎沒有。因此，本研究利用熒光實時定量技術，檢測IRX3基因在秦川牛不同月齡不同組織中的表達情況，以揭示IRX3在秦川牛機體中的表達規(guī)律，為秦川牛的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試組織與器官 供試材料包括3頭秦川牛胎牛(妊娠3個月的胎兒)的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、肌肉(背最長肌)，3頭6月齡秦川牛的心臟、肝臟、肺臟、大腸、小腸、肌肉(背最長肌)，3頭24月齡秦川牛的心臟、肝臟、肺臟、大腸、肌肉(背最長肌)，以及6月齡、18月齡、24月齡、60月齡秦川牛的脂肪組織，所有組織器官均由西北農(nóng)林科技大學國家肉牛改良中心種質(zhì)資源庫于-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 Trizol試劑和總RNA提取試劑盒，TIANGEN?公司產(chǎn)品；天凈沙RNase清除劑A型，北京天恩澤?公司產(chǎn)品；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Primix ExTaqTMⅡ試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品；7500 Real Time PCR儀，ABI公司產(chǎn)品。

1.2 牛組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄PCR

用Trizol法提取牛組織總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測法和分光光度計檢測法對所提RNA的品質(zhì)進行檢測。將品質(zhì)符合要求的組織總RNA用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)，反應得到的cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.3 IRX3表達量的實時熒光定量檢測

1.3.1 引物設計 選用GAPDH、β-actin、B2M、Ubiquitin和18S rRNA 為內(nèi)參基因，檢測其在各待測組織中的表達情況，利用NormFinder和geNorm進行分析，通過計算穩(wěn)定值來確定最適內(nèi)參數(shù)量及最佳內(nèi)參，結(jié)果顯示GAPDH為最佳內(nèi)參基因，因此選用GAPDH為內(nèi)參進行試驗。根據(jù)秦川牛IRX3的mRNA序列設計實時定量特異性引物，交由TaKaRa?公司合成；GAPDH引物由本實驗室保存。引物相關信息見表1。

1.3.2 實時熒光定量技術 用SYBR?Primix ExTaqTMⅡ試劑盒進行實時定量PCR，反應體系為20 μL，其中SYBR?Primix ExTaqⅡ10 μL，上、下游引物各 0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板 2 μL，dH2O 6 μL。反應在7500 Real Time PCR儀(ABI公司產(chǎn)品)上進行，具體循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，循環(huán)40次。熔解曲線程序為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣品進行3次重復試驗。

表1 IRX3和GAPDH的qRT-PCR引物Table 1 Primers of qRT-PCR of IRX3 and GAPDH

1.4 數(shù)據(jù)處理

用待測基因的Ct值減去對應的內(nèi)參基因GAPDH的Ct值,即可得到每種組織的ΔCt值，在待測組織中選擇一種組織作為參照(其表達量設定為1)，采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)并分析相對表達量[16-17]，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。

相對表達量用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦川牛胎牛IRX3基因的組織表達規(guī)律

以IRX3基因在肝臟中的表達量為參照，其在秦川牛胎牛8個不同組織中的相對表達量見圖1。

圖柱上標不同小寫字母表示組織間差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示組織間差異極顯著(P<0.01)。圖2,3同Different lowercase letters mean significant difference among tissues at P<0.05,different capital letters mean extremely significant difference at P<0.01.The same for Fig.2 and Fig.3圖1 秦川牛胎牛IRX3基因的組織表達規(guī)律Fig.1 mRNA expression of IRX3 gene in different tissues of Qinchuan fetal bovine

由圖1可知，在所檢測的組織中，肺臟IRX3基因的表達量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)；其次是腎臟，其IRX3基因的表達量極顯著高于除肺臟外的其他組織(P<0.01)；再次是心臟，其IRX3基因的表達量顯著高于除肺臟、腎臟外的其他組織(P<0.05)；肝臟、脾臟、大腸、小腸和肌肉等組織中IRX3基因表達量極低。表明IRX3基因在秦川牛胎牛時期與肺臟和腎臟發(fā)育緊密相關。

2.2 6月齡秦川牛IRX3基因的組織表達規(guī)律

以IRX3基因在大腸中的表達量為參照，其在6月齡秦川牛6個不同組織中的相對表達量如圖2所示。由圖2可知，在所檢測的組織中，肺臟IRX3基因的表達量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)；其次是心臟，IRX3基因表達量顯著高于除肺臟外的其他組織(P<0.05)；肝臟、大腸、小腸和肌肉中IRX3表達量很低。表明IRX3基因在秦川牛6月齡時對肺臟和心臟的發(fā)育有一定影響。

2.3 24月齡秦川牛IRX3基因的組織表達規(guī)律

以IRX3基因在肌肉中的表達量為參照，其在24月齡秦川牛5個不同組織中的相對表達量見圖3。由圖3可知，在所檢測的組織中，肺臟中IRX3基因表達量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)；其次是心臟和肝臟，其IRX3基因表達量均處于較高水平；大腸和肌肉中IRX3基因表達量很低。

圖2 秦川牛6月齡犢牛IRX3基因的組織表達規(guī)律Fig.2 mRNA expression of IRX3 gene in different tissues of 6-month Qinchuan cattle

2.4 不同年齡秦川牛IRX3基因在相同組織中的表達規(guī)律

以IRX3基因在胎牛時期各組織中的表達量為參照，其在秦川牛不同發(fā)育階段同一組織中的相對表達量如圖4所示。由圖4可知，在心臟和肝臟組織中，IRX3基因的表達量隨著年齡的增長而持續(xù)增高，其中以肝臟的增長幅度最大，并且24月齡時的表達量極顯著高于胎牛和6月齡時期(P<0.01)。對肺臟和大腸而言，IRX3基因在胎牛中的表達量較高，出生后在肺部的表達量有所下降但差異未達顯著水平(P>0.05)，而在大腸中的表達量極顯著降低(P<0.01)；之后隨著年齡的增長，IRX3基因表達量在24月齡達到最高，極顯著高于胎牛和6月齡時期(P<0.01)。各組織中只有肌肉組織IRX3基因在胎牛中的表達量最高，出生后表達量隨著生長發(fā)育而極顯著降低(P<0.01)?？梢?，IRX3基因在不同時期秦川牛同一組織中的表達量均有顯著差異，推測其在秦川牛生長發(fā)育中有較為活躍的功能。

同一組織不同年齡階段相比，圖柱上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Different lowercase letters mean significant difference among age groups at P<0.05,and different capital letters mean extremely significant difference at P<0.01

2.5 IRX3基因在不同時期秦川牛脂肪組織中的表達規(guī)律

以24月齡脂肪組織中IRX3的表達量為參照，其他年齡段脂肪組織中IRX3基因的表達情況如圖5所示。由圖5可以看出，隨著年齡的增長，秦川牛脂肪組織中IRX3基因的表達量呈先升高后降低最后再升高的變化趨勢，18月齡時表達量最高，極顯著高于其他年齡段(P<0.01)；其次是6月齡，IRX3表達量極顯著高于24～60月齡(P<0.01)。

不同年齡相比，圖柱上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Different lowercase letters mean significant difference among age groups at P<0.05,and different capital letters mean extremely significant difference at P<0.01圖5 秦川牛IRX3基因在脂肪組織中的表達規(guī)律Fig.5 mRNA expression of IRX3 gene in fat tissue of Qinchuan cattle

3 討 論

我國地方黃牛資源豐富，但多為役肉或肉役兼用型，產(chǎn)肉量較低，脂肪沉積欠佳[1]。如何依靠地方品種資源和生物技術手段加快黃牛遺傳改良，積極培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)肉牛品種，是我國肉牛產(chǎn)業(yè)和廣大科技工作者面臨的重要課題。研究發(fā)現(xiàn)，IRX3基因在調(diào)節(jié)脊索動物生長發(fā)育、脂肪沉積等方面有重要作用[2-3]。因此，研究IRX3基因在秦川牛組織中的表達情況，對利用現(xiàn)代分子育種方法進行肉脂品質(zhì)改良有重要的指導意義。

IRX3基因作為Iroquois同源盒基因家族的成員之一，具有較高的保守性。該家族的各成員在脊椎動物胚胎的形成模式中參與許多調(diào)控作用[4]。Dankel等[18]對通過外科手術去脂(腹部脂肪)的肥胖患者術前和1年后及正常偏瘦人的相關基因進行檢測后發(fā)現(xiàn)，手術后IRX3、IRX5等基因顯著上調(diào)，從而發(fā)現(xiàn)IRX3是調(diào)控脂肪組織的重要因子。

本研究發(fā)現(xiàn)，在秦川牛胎牛、6月齡、24月齡時，IRX3基因在肺臟組織中的表達量始終最高，并在成年牛時期達到最高；心臟組織的IRX3表達量也處于較高水平，并隨牛生長發(fā)育階段的推進而增大，因此推測該基因與心臟的發(fā)育有著密切聯(lián)系，這點與已有的研究結(jié)果即IRX3可以影響心臟功能相一致[19-23]。IRX3基因在秦川牛肝臟、脾臟、大腸、小腸和肌肉中的表達量都處于較低水平。

在脂肪組織中，IRX3基因的表達情況與生長發(fā)育情況一致，在6到18月秦川?？焖偕L時期極顯著高于其他時期，并且表達量隨年齡增加而增長；而在18～24月齡秦川牛生長變得緩慢，IRX3基因表達量也顯著降低。分析發(fā)現(xiàn)，IRX3基因在脂肪組織中的表達量與牛生長速度正相關，表明IRX3基因在秦川牛發(fā)育過程中與脂肪沉積有密切聯(lián)系。