曾偉超， 許建華， 黃種心

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，約占女性癌癥患者總數(shù)的25%和癌癥總死亡數(shù)的15%。截至2012年，我國(guó)約有乳腺癌患者170萬，其中死亡人數(shù)約52萬[1]。乳腺癌的早期診斷困難，因此，尋找早期診斷的生物指標(biāo)有很大的臨床意義。A20被稱為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TNF-alpha-induced protein 3，TNFAIP3)，是在誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)中檢測(cè)到的一個(gè)誘導(dǎo)性表達(dá)蛋白[2]。A20家族為卵巢腫瘤(ovian tumor，OTU)結(jié)構(gòu)域超家族的一個(gè)亞組。A20鋅指蛋白包含一個(gè)可以水解聚泛素鏈的功能性O(shè)TU結(jié)構(gòu)域[3]。研究表明，A20在非霍奇金淋巴瘤的部分亞型中發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用[4]，但也有文獻(xiàn)報(bào)道，A20可通過提高惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的存活率來發(fā)揮腫瘤增強(qiáng)因子的作用[5]，可見在不同的惡性腫瘤中，A20可能發(fā)揮不同的作用。

本研究基于組織芯片技術(shù)，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)145例乳腺癌組織及與之部分配對(duì)的46例癌旁組織中A20蛋白的表達(dá)，并分析A20的表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，初步探討A20在乳腺癌中發(fā)揮的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 收集2004年8月-2008年12月手術(shù)的女性乳腺癌患者145例，年齡(59.57±12.53)歲(33～88歲)；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌119例，浸潤(rùn)性小葉癌4例，黏液癌2例，導(dǎo)管內(nèi)癌1例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌合并浸潤(rùn)性微乳頭狀癌9例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌合并浸潤(rùn)性小葉癌3例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌合并髓樣癌2例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌合并黏液癌5例。納入和排除標(biāo)準(zhǔn)均遵循乳腺癌臨床病理分期(AJCC第六版)[6]?；颊咝g(shù)前均未行放療、化療及激素治療。

145例乳腺癌組織芯片及與之部分配對(duì)(46例)的癌旁組織芯片均購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司。同一患者的癌組織和癌旁組織形成完全配對(duì)。所有標(biāo)本的使用均征得上海芯超生物科技有限公司倫理委員會(huì)同意，患者本人知情并簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器 TNFAIP3抗體(ab92324，英國(guó)Abcam公司)；聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG(SV0002)及蘇木精染色劑(AR1180-1)(中國(guó)博士德生物工程有限公司)；5% BSA封閉液(SW3015，美國(guó)Solarbio公司)；DAB顯色試劑盒(CW0125)及中性樹脂(CW0136)(中國(guó)康為世紀(jì)生物科技有限公司)；恒溫?fù)u床(TC-100B，中國(guó)上海天呈科技公司)；生物顯微鏡(上海領(lǐng)成生物科技有限公司)；組織芯片掃描儀(美國(guó)Aperio公司)。相關(guān)的雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)及人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)基因表達(dá)狀態(tài)等數(shù)據(jù)由上海芯超生物科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)Envision兩步法檢測(cè)A20蛋白的表達(dá) 組織芯片放入75 ℃烤箱中烤1.5 h；脫蠟：切片在二甲苯Ⅰ脫蠟10 min后，再用二甲苯Ⅱ脫蠟10 min；將切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇及純化水中，各5 min。高壓熱修復(fù)后自然冷卻，用PBS沖洗3次，每次3 min。用0.5% Triton X-100室溫通透20 min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；孵育一抗：水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗TNFAIP3(1∶100)，放入濕盒，4 ℃孵育過夜。切片復(fù)溫45 min后PBS洗滌，滴加兔/鼠二抗工作液，室溫孵育1 h，PBS充分淋洗；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS或自來水沖洗1 min；蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化，返藍(lán)；自來水沖洗1 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3.2組織芯片的掃描讀片及染色結(jié)果判定 讀片結(jié)果采用雙盲法判定，并由2位副高以上職稱的病理醫(yī)師分別讀片后進(jìn)行判定，判定標(biāo)準(zhǔn)采用半定量積分法[7]。在高倍顯微鏡下觀察(×200)，隨機(jī)選擇3個(gè)有代表性的高倍鏡視野進(jìn)行判定并計(jì)分。具體方法如下：(1)染色強(qiáng)度判定，在低倍鏡下進(jìn)行觀察，分為弱、中及強(qiáng)陽(yáng)性，其中弱陽(yáng)性為淺黃色(+或1)、中陽(yáng)性為棕黃色(或2)、強(qiáng)陽(yáng)性為棕褐色(或3)(如組織中既有中陽(yáng)性又有強(qiáng)陽(yáng)性時(shí)，記為2～3，余類似)。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的棕色染色顆粒被視為陽(yáng)性，同時(shí)依據(jù)染色的強(qiáng)度設(shè)定得分值，即染色強(qiáng)度評(píng)分1分(<1)，2分(1<強(qiáng)度≤2)，3分(2<強(qiáng)度≤3)。(2)染色陽(yáng)性率判定，首先在低倍鏡下觀察組織點(diǎn)的整個(gè)視野，然后選取3個(gè)染色強(qiáng)度不同的視野，并在高倍鏡下進(jìn)行判讀，如果定位于胞核或者胞質(zhì)、胞膜，則在每個(gè)視野中隨機(jī)記100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其中的陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率，取3個(gè)不同視野的均數(shù)作為該組織點(diǎn)最終的染色陽(yáng)性率。視野中的著色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<70%為1分，70%～79%為2分，80%～90%為3分時(shí)，91%～100%為4分。(3)總評(píng)分及分組情況，以“染色強(qiáng)度評(píng)分”和“染色陽(yáng)性率評(píng)分”的乘積為總評(píng)分，并進(jìn)行分組，<8分為抗體低表達(dá)組，≥8分為抗體高表達(dá)組。

1.3.3隨訪 通過電話和門診復(fù)查的方式進(jìn)行隨訪，隨訪的起始時(shí)間為患者的手術(shù)時(shí)間，截止時(shí)間為2014年7月，隨訪時(shí)間為5.6～10年。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。A20蛋白在乳腺癌組織及其配對(duì)的癌旁組織中的表達(dá)差異分析采用卡方檢驗(yàn)。生存曲線采用Kaplan-Meier法和Log-rank統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)進(jìn)行分析；單因素及多因素生存分析方法采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。A20的表達(dá)與各臨床病理因素及指標(biāo)之間的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。所有的檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1A20在乳腺癌組織和配對(duì)的癌旁組織中表達(dá)及其與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 因?qū)嶒?yàn)結(jié)果不理想，剔除11組完全配對(duì)的組織樣本，余35組完全配對(duì)的乳腺癌組織與癌旁組織納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。A20蛋白主要表達(dá)于胞質(zhì)中，部分細(xì)胞的胞核亦可著色。35例乳腺癌組織中，高表達(dá)25例(71.4%)，低表達(dá)10例(28.6%)(圖1A，1B)；在配對(duì)的35例癌旁組織標(biāo)本中，高表達(dá)12例(34.3%)，低表達(dá)23例(65.7%)(圖1C，1D)?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，A20蛋白的表達(dá)在乳腺癌組織和配對(duì)的癌旁組織中存在差異(P<0.05)。運(yùn)用Spearman秩相關(guān)方法對(duì)A20的表達(dá)與145例乳腺癌患者的臨床病理參數(shù)之間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果示二者間不存在直線相關(guān)關(guān)系(P>0.05,表1)。

2.2A20表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)性分析 145例中，A20高表達(dá)71例，其中死亡29例，生存42例，生存率為59.2%；A20低表達(dá)74例，其中死亡14例，生存60例，生存率為81.1%。高表達(dá)組的平均生存時(shí)間為84.055月，95%CI為(75.200～92.910)；低表達(dá)組的平均生存時(shí)間為102.170月，95%CI為(93.905～110.435)(表2)。2組的生存曲線見圖2，可見高表達(dá)A20組患者的總體生存率明顯低于低表達(dá)組(χ2=8.492，P=0.004)。

A20蛋白主要表達(dá)于胞質(zhì)中，其中A,C圖為高表達(dá)，B,D圖為低表達(dá)； A,B：癌組織； C,D：癌旁組織.圖1 A20在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)( ×400)Fig 1 Expression of A20 protein in breast cancer tissue and para-carcinoma tissue( ×400)

表1A20在145例乳腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征之間的關(guān)系

Tab1Correlation between the clinicopathological characteristics and A20 expression in breast cancer tissue

臨床參數(shù)nA20表達(dá)高低秩相關(guān)系數(shù)P值年齡/歲 <60844440-0.0510.544 ≥60612734病理分級(jí) 1440 2703535-0.1020.244 3713239d腫瘤/cm <2351223 2～58845430.1640.053 >51587 侵犯胸壁或皮膚220淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無743440 有6935340.0480.571TNM分期 0110Ⅰ228140.0910.283Ⅱ783741Ⅲ392118

表2乳腺癌中A20高表達(dá)組和低表達(dá)組生存時(shí)間的平均值和95%可信區(qū)間

Tab2Mean value and 95% confidence interval of overall survival time between A20 high expression group and A20 low expression group in breast cancer

A20表達(dá)估算標(biāo)準(zhǔn)誤差95%CI下限95%CI上限低表達(dá)102.1704.21793.905110.435高表達(dá)84.0554.51875.20092.910總體94.7093.22488.391101.027

2.3Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的單因素和多因素分析 將患者的年齡、TNM分期、病理分級(jí)、腫瘤大小及部位、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)侵犯及A20的表達(dá)水平等可能影響乳腺癌預(yù)后的因素進(jìn)行單因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T分期(P=0.011)、N分期(P=0.005)、TNM綜合分期(P=0.004)及A20的表達(dá)水平(P=0.005)與乳腺癌患者的總生存率之間存在相關(guān)。對(duì)這些臨床參數(shù)進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析結(jié)果顯示，A20的表達(dá)水平(P=0.038)仍是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素(表3)。

圖2 乳腺癌中高表達(dá)A20組和低表達(dá)A20組的生存曲線Fig 2 Survival curves of A20 high expression group and A20 low expression group in breast cancer

2.4A20的表達(dá)與其他相關(guān)臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析 運(yùn)用Spearman秩相關(guān)分析A20表達(dá)與AR,Ki-67,P53,PR,ER,EGFR和HER-2基因的表達(dá)狀態(tài)之間的相關(guān)性，顯示P>0.05，可見二者之間不存在直線相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

A20蛋白是1990年第1次被發(fā)現(xiàn)的，它最為人們所熟知的作用是通過抑制NF-κB信號(hào)通路來抑制炎癥。早有研究發(fā)現(xiàn)，A20可以結(jié)合到一種名為結(jié)合A20的NF-κB抑制因子(A20-bindind inhibitors of NF-κB activation，ABIN)的蛋白上，而這種蛋白通過過表達(dá)來模擬A20抑制NF-κB的作用，表明A20的作用是通過與ABIN這種NF-κB抑制蛋白的相互作用來實(shí)現(xiàn)的[8]。

A20在腫瘤中發(fā)揮的作用一直有2種不同意見。有研究發(fā)現(xiàn)，A20可作為一個(gè)腫瘤的抑制因子，如在多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的研究中發(fā)現(xiàn)，A20基因的失活可以通過構(gòu)成性的NF-κB的激活來促進(jìn)MM的發(fā)病，這種失活作用并非通過體細(xì)胞突變或啟動(dòng)子的甲基化，而是通過A20基因的缺失來實(shí)現(xiàn)[9]。對(duì)膿胸相關(guān)淋巴瘤(pyothorax-associated lymphoma，PAL)的研究也發(fā)現(xiàn)，A20基因不正常表達(dá)常與PAL相關(guān)，且A20的異常可能與PAL的發(fā)病有關(guān)[10]。相反，在對(duì)結(jié)腸癌、結(jié)腸息肉和炎癥性腸病中A20與P53表達(dá)的相關(guān)性研究卻發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織、腺瘤樣息肉以及增生性息肉的上皮組織中，A20表現(xiàn)出高表達(dá)，且與結(jié)腸息肉的癌變傾向呈正相關(guān)關(guān)系，A20在炎癥性息肉中的表達(dá)低于在腺瘤樣息肉以及增生性息肉的上皮組織中的表達(dá)，且炎癥性息肉也顯示了較低的癌變傾向；同時(shí)研究人員還發(fā)現(xiàn)，A20可以與P53結(jié)合形成復(fù)合體，且在HEK293細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)A20可在蛋白水平上抑制P53[11]。類似的結(jié)果也見于對(duì)膀胱癌及膀胱息肉的相關(guān)研究中[12]。

表3影響乳腺癌預(yù)后因素的Cox單因素和多因素分析

Tab3Univariate and multivariate analysis of factors which affect breast cancer patients' prognosis using Cox proportional hazards model

臨床病理參數(shù)單因素分析HR95%CIP值多因素分析HR95%CIP值A(chǔ)20的表達(dá)2.5211.323～4.8040.005☆2.0271.038～3.9580.038☆病理分級(jí)0.9270.539～1.5950.784年齡0.9730.531～1.7840.930T分期1.7541.137～2.7080.011☆1.4460.734～2.8520.287N分期1.4741.121～1.9380.005☆1.4410.839～2.4730.185TNM分期2.1121.272～3.5070.004☆0.9900.323～3.0400.986

☆：P<0.05.

組織芯片技術(shù)的發(fā)展，允許科研工作者高效率地完成多樣本的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，從而能夠初步研究一個(gè)基因可能發(fā)揮的作用，并分析其與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。在應(yīng)用組織芯片技術(shù)研究胰腺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，A20蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯低于正常的胰腺組織，因此，A20在胰腺癌的發(fā)病過程中可能發(fā)揮了潛在的作用[13]。本研究應(yīng)用組織芯片技術(shù)研究乳腺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，A20蛋白在乳腺癌組織及其配對(duì)的癌旁組織中的表達(dá)存在差異，但Spearman秩相關(guān)方法檢測(cè)結(jié)果顯示，A20的表達(dá)與患者年齡、病理分級(jí)、T分期、N分期和TNM綜合分期之間不存在直線相關(guān)關(guān)系。采用Kaplan-Meier生存分析法和Log-rank統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)進(jìn)行生存期單因素分析，可知高表達(dá)A20組患者的總體生存率明顯低于低表達(dá)組，二者間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)，A20的表達(dá)可以作為影響乳腺癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。因此對(duì)A20表達(dá)情況的檢測(cè)有可能成為判斷乳腺癌惡性病變程度和評(píng)估預(yù)后的參照因素，同時(shí)提示高表達(dá)的A20可能參與了乳腺癌的疾病發(fā)展過程并影響患者的預(yù)后。運(yùn)用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)分析A20表達(dá)與AR，Ki-67，P53，PR，ER，EGFR和HER-2的表達(dá)狀態(tài)之間的相關(guān)性，顯示P>0.05，二者也不存在直線相關(guān)關(guān)系。

本研究認(rèn)為，A20的高表達(dá)是影響乳腺癌患者預(yù)后的不利因素，A20可能參與了乳腺癌患者疾病的進(jìn)展，因此A20有望成為一個(gè)檢測(cè)乳腺癌患者疾病發(fā)展及預(yù)后的新型生物學(xué)指標(biāo)。然而，A20在乳腺癌的發(fā)病機(jī)制中所起的作用還需進(jìn)一步進(jìn)行蛋白及分子水平的功能驗(yàn)證。