羅彤，付文雯，郭盧云，王會霞，*

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北武漢430070；2.湖北輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070）

草甘膦（glyphosate，Gly），屬于廣譜、非選擇性、滅生性除草劑，由于其具有低廉的價格和優(yōu)良的除草性能，廣泛的應(yīng)用于橡膠、果園、茶園等少、免耕田除草以及高稈作物田行間定向保護(hù)性噴霧除草[1]。草甘膦在環(huán)境和生物體中富集并通過食品進(jìn)入人體，會對人體健康造成危害。近年來，茶葉中草甘膦及其主要代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸殘留量超標(biāo)的問題時有發(fā)生，這已經(jīng)影響到消費者的食用安全及茶葉的出口貿(mào)易。因此建立一種簡便、快捷、有效的草甘膦殘留的檢測方法具有重要的意義。

草甘膦和氨甲基膦酸都極易溶于水，難溶于有機試劑，揮發(fā)性低，難以氣化，缺少生色基團(tuán)，難以直接利用常規(guī)方法進(jìn)行檢測[2]。目前，草甘膦的測定常涉及一些特殊的技術(shù)手段，如柱前或柱后衍生化處理[2-5]、采用離子交換色譜[6]等進(jìn)行分析。我國現(xiàn)有的國標(biāo)方法[7]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[8]中，前處理采用固相萃取小柱凈化，洗脫液中水含量高，濃縮時間長，費時費力。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe） 技術(shù)是一種快速、簡單、廉價、高效的樣品前處理方法，主要通過非極性相互作用、極性相互作用、離子相互作用等選擇性保留基質(zhì)干擾成分，進(jìn)而達(dá)到凈化的效果。QuECh－ERS可以根據(jù)不同樣品基質(zhì)以及不同目標(biāo)物的理化特性差異，并且通過調(diào)整提取溶劑、吸附劑等來改進(jìn)QuEChERS前處理技術(shù)，讓其應(yīng)用于更加廣泛的領(lǐng)域，但QuEChERS在茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸的檢測應(yīng)用報道較少，曹慧等[9]建立了QuEChERS前處理和液質(zhì)質(zhì)相結(jié)合快速測定了茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸含量的方法。國標(biāo)中的氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 能夠?qū)δ繕?biāo)化合物進(jìn)行確證，但是單離子監(jiān)測（Single ion monitoring，SIM）模式采集的質(zhì)譜信息較少，選擇性差，易受基質(zhì)干擾，在定性方面存在不足，容易造成假陽性結(jié)果，而氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS） 采用選擇反應(yīng)監(jiān)測（Selective reaction monitoring，SRM）數(shù)據(jù)采集模式，可以有效排除基質(zhì)干擾，使定性定量結(jié)果更加可靠[10]。因此本研究擬采用柱前三氟乙酸酐-七氟丁醇衍生和改進(jìn)的QuEChERS前處理方法，通過GC-MS/MS分析樣品，確定柱前衍生-QuEChERS-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸殘留的方法，為實現(xiàn)茶葉中有草甘膦和氨甲基膦酸殘留的快速監(jiān)測提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TSQ 8000evo氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；XS204分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Allegra 6412冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特公司；MDF-U54V-PC立式超低溫冰箱：日本三洋電器集團(tuán)；WNE 29水浴振蕩器：德國美墨爾特有限公司；Mill-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司；XH-C渦旋混合器：江蘇金怡儀器科技公司；2600T超聲波清洗器：上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

草甘膦（純度≥99.0%）、氨甲基膦酸（純度≥99.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；三氟乙酸酐、七氟丁醇（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；二氯甲烷、乙酸乙酯（色譜純）：德國Merck公司；檸檬醛（分析純）：阿拉丁試劑有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳（graphitized carnon black，GCB）、C18：博納艾杰爾科技有限公司；綠茶、紅茶、烏龍茶樣品為實驗室送檢樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和衍生劑的配制

稱取草甘膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.05 g，用水溶解并定容至50 mL塑料容量瓶，配制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃下保存待用。

草甘膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用超純水逐級稀釋成濃度為 5、10、25、50、100、250、500 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

衍生劑：三氟乙酸酐-七氟丁醇溶液，將三氟乙酸酐和七氟丁醇溶液2∶1的體積比混合，臨配臨用，并于-80℃冰箱保存。

1.3 樣品前處理

試樣制備：選取茶葉樣品，用四分法縮減取200 g，粉碎后過1.0 mm孔徑篩，混勻備用。

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.001 g），置于聚乙烯塑料離心管中，加入25 mL水，渦旋30 s，超聲20 min，于3 500 r/min離心10 min。取上清液15 mL至離心管加入15 mL二氯甲烷振蕩2 min，于3 500 r/min離心5 min。取上清液待衍生。

取1.6 mL衍生劑于衍生瓶中，加蓋后放入-80℃超低溫冰箱冷凍0.5 h后取出，用移液槍在衍生劑液面下加入50 μL提取上清液，加蓋混勻后90℃衍生1 h。取出冷卻至室溫，用氮氣吹干，并繼續(xù)氮吹0.5 h，加入2 mL 0.2%檸檬醛乙酸乙酯溶液溶解殘渣，待凈化。

取2 mL衍生液，加50 mg PSA粉末，25 mg C18粉末，25 mg GCB粉末，渦旋30 s，靜置至上層液體無渾濁物；取上層液體過0.22 μm濾膜后上機測定。

標(biāo)準(zhǔn)品按照上述方法衍生后，加入2 mL 0.2%檸檬醛乙酸乙酯溶液溶解殘渣過0.22 μm濾膜后上機測定。

1.4 氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：TG-1701MS毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：80℃保持 1.5 min，以 30℃/min升溫至270℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度200℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊（electron Ionization，EI）離子源；電離能量70 eV，離子源溫度為280℃，傳輸線溫度為270℃，溶劑延遲時間為3.5 min，掃描模式為選擇反應(yīng)監(jiān)測（selective reaction monitoring，SRM），優(yōu)化后的保留時間、定性和定量離子對及其碰撞能量信息見表1。

表1 草甘膦和氨甲基膦酸衍生物質(zhì)譜條件參數(shù)Table1 MS conditions for derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

圖1 草甘膦和氨甲基膦酸衍生物在選擇反應(yīng)監(jiān)測模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）in selected reaction monitoring（SRM）mode

2 結(jié)果及討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本文采用GC-MS/MS進(jìn)行檢測，使用單針進(jìn)樣分析目標(biāo)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)衍生液，對草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物進(jìn)行質(zhì)譜全掃描分析，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[7]，確定草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物的保留時間?；衔镞M(jìn)入一級質(zhì)譜后，確定母離子，母離子進(jìn)入二級質(zhì)譜，對化合物的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。通過Auto SRM軟件，對化合物母離子逐步施加一定步長碰撞能量，目標(biāo)化合物發(fā)生斷裂或重排，產(chǎn)生不同離子碎片，每個目標(biāo)化合物選取兩對最具特征且響應(yīng)最高的子離子，最終確定出定性離子對、定量離子對和各個物質(zhì)的質(zhì)譜采集參數(shù)。SRM模式能夠最大限度地消除基質(zhì)干擾，而且針對化合物掃描時間窗口的設(shè)置，提高了靈敏度。草甘膦和氨甲基膦酸的衍生物在SRM模式下的總離子流圖如圖1所示。

由圖1可知，氨甲基膦酸衍生物保留時間為5.93 min；草甘膦衍生物保留時間為6.13 min。

2.3 QuEChERS方法的優(yōu)化

2.3.1 凈化方式的選擇

分散固相萃取常用的凈化劑有PSA、石墨化炭黑（GCB）和C18等。PSA可吸附糖、有機酸、脂肪酸等極性干擾物；C18可吸附脂肪等非極性干擾物；GCB可吸附色素、甾醇等大分子非極性干擾物[11]。本試驗首先分別選用PSA、C18和GCB對加標(biāo)茶葉樣品提取液進(jìn)行凈化，試驗結(jié)果表明：PSA和GCB對草甘膦和氨甲基磷酸具有較強的吸附性，目標(biāo)化合物的回收率都低于10%，原因是PSA對分子結(jié)構(gòu)中帶有羧基的化合物有一定的保留作用[12]；GCB表面是正六元環(huán)結(jié)構(gòu)，對平面分子有極強的親和力[13]，因此會吸附平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，導(dǎo)致回收率低，而C18在水提取液中容易結(jié)塊，凈化效果不佳。因此，QuEChERS法不適用于草甘膦和氨甲基膦酸提取液的直接凈化處理。

草甘膦和氨甲基膦酸用三氟乙酸酐和七氟丁醇衍生劑衍生后，氨基基團(tuán)被衍生為相應(yīng)的三氟乙酰衍生物，羧基和膦酸基團(tuán)被衍生形成相應(yīng)的七氟丁酯。因此，本試驗擬先用衍生劑將草甘膦和氨甲基膦酸衍生，然后采用QuEChERS前處理法凈化衍生液，降低對離子源的污染，提高靈敏度。本試驗以50 μg/L加標(biāo)水平的茶葉為考察對象，提取液衍生后進(jìn)行凈化處理，并以PSA、GCB、C18的用量為考察因素對凈化條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.1.1 凈化劑的用量

考察加入的PSA用量對凈化效果的影響，試驗結(jié)果見圖2。

圖2 2 mL加標(biāo)提取液中PSA用量對草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物回收率的影響Fig.2 Effect of the amount of PSA added in 2 mL extract on the recoveries of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

在2 mL加標(biāo)基質(zhì)衍生液中分別加入20、50、100、150、200 mg PSA。PSA具有弱陰離子交換（水溶性基質(zhì)）、極性（非極性有機基質(zhì)）螯合作用，可有效去除樣品中的有機酸、脂肪酸和糖等干擾物。草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的回收率隨著PSA用量的增加呈現(xiàn)先增加后下降的狀態(tài)，并在PSA為50 mg時達(dá)到最大值。PSA材料的硅膠表面鍵合有極性功能團(tuán)，能吸附極性化合物，而草甘膦和氨甲基膦酸是屬于極性較強的化合物，PSA用量過大，吸附完雜質(zhì)，過多的PSA會對目標(biāo)化合物產(chǎn)生吸附，因此，最終選用PSA用量為50 mg。

固定PSA用量為50 mg，考察加入的C18用量對凈化效果的影響，試驗結(jié)果見圖3。

圖3 2 mL加標(biāo)提取液中C18用量對草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物回收率的影響Fig.3 Effect of the amount of C18 added in 2 mL extract on the recoveries of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

在2 mL加標(biāo)基質(zhì)衍生液中分別加入10、25、50、75、100 mg C18。C18吸附劑對極性較弱的脂肪酸、烯烴類及甾醇類、色素等大分子基質(zhì)干擾物有較好的吸附效果。試驗發(fā)現(xiàn)，隨著C18用量的增加，草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的回收率變化不大，綜合回收率和經(jīng)濟(jì)因素，我們最終選用C18為25 mg。

固定 PSA（50 mg）、C18（25 mg）用量，考察 GCB 用量對凈化效果的影響，試驗結(jié)果見圖4。

圖4 2 mL加標(biāo)提取液中GCB用量對草甘膦和氨甲基膦酸衍生物回收率的影響Fig.4 Effect of the amount of GCB added in 2 mL extract on the recoveries of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

在 2 mL 衍生液中分別加入 10、25、50、75、100 mg GCB。GCB能去除部分色素、類胡蘿卜素、固醇和具有平面結(jié)構(gòu)等極性大的基質(zhì)干擾物，過多的GCB會對目標(biāo)化合物產(chǎn)生吸附，因此，最終選用GCB用量為25 mg。

綜合各種因素，在2 mL衍生液中加入50 mg PSA、25 mg C18、25 mg GCB組合凈化劑較好。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

以一系列質(zhì)量濃度（5 μg/L～500 μg/L）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在確定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（單位μg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比計算檢出限（LOD），以10倍信噪比計算定量限（LQD）。草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。

試驗結(jié)果表明，草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999 0。草甘膦和氨甲基膦酸的檢出限分別是0.01 mg/kg和0.005 mg/kg；定量限分別是0.03 mg/kg和0.015 mg/kg。

表2 草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和方法定量限Table2 Linear equations，correlation coefficients，LOD，and LQD of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

為了驗證QuEChERS前處理方法聯(lián)合GC-MS/MS測定茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸的可行性和準(zhǔn)確性，試驗采用不同空白茶葉基質(zhì)樣品（綠茶、紅茶、烏龍茶）進(jìn)行加標(biāo)回收率驗證，加標(biāo)水平分別為0.50、1.00、2.50 mg/kg，按照前述方法處理平行測定6次，回收率和精密度見表3。

試驗結(jié)果表明，不同茶葉基質(zhì)中草甘膦和氨甲基膦酸的方法回收率分別為86.1%～101.2%和83.6%～103.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%～6.7%和3.6%～7.3%，低于10%。圖5為0.50 mg/kg加標(biāo)綠茶樣品的二級總離子色譜圖。

圖5 0.50 mg/kg加標(biāo)綠茶樣品溶液中草甘膦和氨甲基膦酸衍生化合物的定量離子色譜圖Fig.5 Quantitative ion chromatograms of derived compounds in 0.50 mg/kg spiked concentration levels of green tea

3 結(jié)論

本試驗通過對前處理方式、凈化劑用量的優(yōu)化，建立了茶葉中草甘膦及氨甲基膦酸殘留量的柱前衍生-QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析方法。該方法簡單、快速、基質(zhì)干擾小、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于茶葉中草甘膦及氨甲基膦酸殘留量的定量檢測，可為茶葉的安全監(jiān)管及質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。