王清，劉濤，夏新奎，田俊雅

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院食品學(xué)院，河南信陽(yáng)464000）

枸骨（Ilex cornuta）有貓刺、老虎刺等20多種別名，為常綠灌木或小喬木，主要種植在上海市、安徽、江蘇、浙江、江西、湖南、湖北等地區(qū)[1]。

枸骨的化學(xué)成分主要有黃烷類(lèi)、三萜苷類(lèi)、苯丙素類(lèi)等多種有機(jī)化合物[2-5]，經(jīng)研究證明[6-9]其有抗炎殺菌、降低心肌收縮、抗氧化、抗腫瘤有顯著作用。枸骨果實(shí)可供藥用，常用于治療白帶過(guò)多和慢性腹瀉，也用于陰虛身熱、淋濁、崩帶、筋骨疼痛等癥[10-12]。

枸骨果實(shí)中還含有豐富的多糖。多糖是一種重要的生命物質(zhì)，它參與了細(xì)胞的多種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，并且可以強(qiáng)化機(jī)體自身的免疫功能。能夠增強(qiáng)多種細(xì)胞因子的分泌，且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)任何毒副作用，這是多糖區(qū)別于其它藥物的一大優(yōu)勢(shì)，該特點(diǎn)有利于我們進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新藥，并不斷研發(fā)其在保健食品和功能性食品中的應(yīng)用，這是多糖區(qū)別于其它藥物的一大優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)際國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上，具有抗腫瘤、治療艾滋病等抗病毒藥及具延緩衰老作用的天然植物多糖提取物有廣闊的市場(chǎng)前景。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)枸骨果實(shí)化學(xué)成分及功效進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道較少，尤其是對(duì)枸骨果實(shí)多糖的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，研究?jī)?yōu)化枸骨果實(shí)多糖的提取工藝對(duì)枸骨果實(shí)資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要的科學(xué)和實(shí)用價(jià)值。

1 材料與儀器

枸骨果實(shí)采于信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院羊山校區(qū)，經(jīng)信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院藥用植物教研室鑒定為枸骨果實(shí)，干燥后粉碎備用；葡萄糖：上海行知化工廠；苯酚、濃硫酸、丙酮、乙醚、乙醇（均為國(guó)產(chǎn)分析純）；TU-1810型紫外線(xiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；WK-4008高速藥物粉碎機(jī)：青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司；LDZ4-0.8型離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；H-H6型電熱恒溫水浴鍋：北京科委永興儀器有限公司；FA1004型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 枸骨果實(shí)多糖制備工藝流程

枸骨果實(shí)粉末→熱水浸提→離心→取上清液減壓濃縮→加無(wú)水乙醇沉淀→丙酮、乙醚洗滌沉淀→真空干燥枸骨果實(shí)粗多糖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制（硫酸-苯酚法）補(bǔ)充參考文獻(xiàn)

采用苯酚-硫酸法制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。最終得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為：Y=5.448 6X+0.004 7,R2=0.992 5。

2.3 單因素試驗(yàn)

分別研究提取時(shí)間、提取溫度和料液比對(duì)枸骨果實(shí)多糖提取率的影響。

2.4 提取率的計(jì)算

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)優(yōu)化枸骨果實(shí)多糖提取率的響應(yīng)面試驗(yàn)。依據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò)建立多元二次回歸模型方程，用多項(xiàng)式對(duì)本試驗(yàn)中各個(gè)因素與指標(biāo)的相互關(guān)系進(jìn)行近似擬合，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析及各因素交互作用的響應(yīng)面圖形分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 提取時(shí)間對(duì)枸骨果實(shí)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 0 g枸骨果實(shí)粉末，加入150 mL蒸餾水，設(shè)置提取溫度為80℃，5份樣品的提取時(shí)間分別為 0.5、1、1.5、2、2.5 h，在恒溫水浴鍋中進(jìn)行提取，冷卻離心（1 000 r/min、10 min）。得上清液，測(cè)定上清液的吸光度。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

如圖1所示，當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最大值。在0.5 h～1.5 h之間，隨著提取時(shí)間增加，多糖提取率不斷提高，當(dāng)提取時(shí)間大于1.5 h時(shí)，多糖提取率數(shù)增長(zhǎng)緩慢。因此，考慮到能源消耗與提取率的大小等問(wèn)題，提取時(shí)間選擇在1.5 h。

3.1.2 提取溫度對(duì)枸骨果實(shí)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 0 g枸骨果實(shí)粉末，加入150mL蒸餾水，提取時(shí)間設(shè)定為1.5 h，5份樣品的提取溫度分別為 60、70、80、90、100 ℃，在恒溫水浴鍋中進(jìn)行提取，冷卻離心（1 000 r/min，10 min）。得上清液，測(cè)定上清液的吸光度。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖1 時(shí)間對(duì)枸骨果實(shí)多糖提取率的影響Fig.1 Effects of time on extraction rate of polysaccharide from fruits of Ilex cornuta

圖2 提取溫度對(duì)枸骨果實(shí)多糖提取率的影響Fig.2 Effects of temperatures on extraction rate of polysaccharide from fruits of Ilex cornuta

圖2 所示，當(dāng)提取溫度為80℃時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最大值。在60℃～80℃之間，隨著提取溫度升高，多糖的提取率不斷提高，當(dāng)提取溫度大于80℃時(shí)，提取率下降。分析原因可能是溫度過(guò)高會(huì)加大試驗(yàn)過(guò)程中的能源消耗與多糖的分解，造成提取量的降低，因此提取溫度應(yīng)選擇在80℃左右。

3.1.3 料液比對(duì)枸骨果實(shí)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 0 g枸骨果實(shí)粉末，5份樣品的液料比分別為 115∶1、130∶1、150∶1、165∶1、185∶1（mL/g），提取時(shí)間設(shè)定為1.5 h，提取溫度設(shè)定為80℃，在恒溫水浴鍋中進(jìn)行提取，冷卻離心（1 000 r/min、10 min）。得上清液，測(cè)定上清液的吸光度。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)枸骨果實(shí)多糖提取率的影響Fig.3 Effects of ratio of water to material on extraction rate of polysaccharide from fruits of Ilex cornuta

如圖3所示，當(dāng)液料比達(dá)到 150∶1（mL/g）時(shí)，多糖提取率的增長(zhǎng)趨勢(shì)趨于緩慢。當(dāng)水料比小于150∶1（mL/g）時(shí)，由于樣品中的多糖沒(méi)有充分溶解在溶液中，因此，隨著液料比的增大，提取率在升高。水分體積的增加與樣品間接觸面積增大，因而有更多的多糖充分的溶解在水溶液中，直至水溶液體積過(guò)大多糖不再溶解。從節(jié)約能源與簡(jiǎn)化后續(xù)操作角度考慮，水料比應(yīng)選擇在 150 ∶1（mL/g）左右。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化枸骨果實(shí)多糖提取工藝

3.2.1 分析因素的選擇及分析方案

根據(jù)單因素枸骨果實(shí)多糖提取工藝參數(shù)，可確定3個(gè)因素和3個(gè)水平進(jìn)行枸骨果實(shí)多糖提取響應(yīng)曲面試驗(yàn)，設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，響應(yīng)曲面試驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table1 Factors and levels of the response surface analysis

表2 試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table2 Test approaches and result of the response surface analysis

續(xù)表2 試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Test approaches and result of the response surface analysis

3.2.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

使用Design Expert 8.0.5對(duì)表2中枸骨果實(shí)多糖提取率多元回歸擬合，得到回歸方程：

Y=28.04+0.15A+0.86B-1.32C-0.38AB+2.42AC+1.45BC-5.83A2-4.53B2-7.45C2中，該方程可以表示液料比、提取溫度、提取時(shí)間三因素與提取率的關(guān)系。Y為枸骨多糖的提取率，%；A為提取溫度，℃；B為提取時(shí)間，h；C為液料比，mL/g，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析如表3所示。

表3 響應(yīng)面回歸方程的方差分析Table3 Analysis of variance of the response surface regression equation

從表3可知P＞F值表示大于F值的概率，根據(jù)P值判斷各交互項(xiàng)極其顯著影響枸骨果實(shí)多糖的提取率，P＜0.01 為極顯著，0.01＜P＜0.05為顯著，P＞0.05 為不顯著。經(jīng)過(guò)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)可知A、B的P＞0.05說(shuō)明差異不顯著，C 的 P＜0.05 差異顯著，A2、B2、C2、AC 的P＜0.01差異極其顯著?；貧w方程相關(guān)系數(shù)平方R2=0.978 8，校正相關(guān)系數(shù)平方Radj=0.951 5。說(shuō)明該方程可用來(lái)分析提取枸骨果實(shí)多糖的優(yōu)化條件，說(shuō)明3個(gè)因素交互作用共同影響多糖提取率，不是單一作用的結(jié)果。

3.2.3 多糖提取率的響應(yīng)面分析

根據(jù)二次模型所做的響應(yīng)曲面圖可評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素對(duì)枸骨果實(shí)多糖提取率的兩兩交互作用，以及確定各因素的最佳水平范圍。等高線(xiàn)形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，等高線(xiàn)形狀是橢圓形表示兩因素交互作用顯著，如果是圓形則表示兩交互作用可忽略。兩兩因素交互作用對(duì)枸骨果實(shí)多糖提取率影響的響應(yīng)面3D圖如圖 4、圖 5、圖 6。

圖4 提取時(shí)間和提取溫度對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time and extraction temperature on extraction rate

由圖4可知：隨時(shí)間和提取溫度的增大，枸骨多糖提取率值呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在提取溫度80℃，液料比150∶1（mL/g）左右，枸骨多糖提取率數(shù)值最大。通過(guò)曲面斜率與試驗(yàn)因素的影響大小的關(guān)系可知，溫度對(duì)考察指標(biāo)的影響更大。

圖5 提取時(shí)間和液料比對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time and liquid to material ratio on extraction rate

由圖5可知：曲線(xiàn)比較陡峭，二者對(duì)提取率的影響作用較大。在相同溫度條件下，隨著液料比、提取時(shí)間的增加，枸骨多糖提取會(huì)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。液料比為150∶1（mL/g），提取時(shí)間為1.5 h時(shí)枸骨多糖提取率數(shù)值最大。

圖6 提取溫度和液料比對(duì)枸骨多糖提取率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature and liquid to material ratio on extraction rate

通過(guò)曲面斜率與試驗(yàn)因素的影響大小的關(guān)系，由圖6可知，與提取溫度相比，提取液料比對(duì)所考察指標(biāo)的影響更大。在相同的時(shí)間條件下，隨著溫度和液料比的增加，枸骨多糖提取率會(huì)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，但是減小的趨勢(shì)比增加的趨勢(shì)小。提取溫度為80℃，液料比為150∶1（mL/g）時(shí)枸骨多糖提取率數(shù)值最大。

3.2.4 試驗(yàn)的驗(yàn)證

通過(guò)Design Expert8.0.6.0分析得到模型的極大值點(diǎn)為：料液比 150 ∶1（mL/g）、提取溫度 80℃、提取時(shí)間1.5h。最佳提取率為29.12%。為了驗(yàn)證試驗(yàn)方案的有效性，設(shè)計(jì)3組平行試驗(yàn)，取平均值得實(shí)際提取率為28.84%。實(shí)際值與理論值相差0.96%，誤差較小。所以通過(guò)Design expert 8.0.6.0軟件得到的枸骨果實(shí)多糖提取率的回歸方程有效，具有參考價(jià)值。

4 結(jié)論

由單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果可知，枸骨果實(shí)多糖提取工藝的最佳條件為：液料比為150∶1（mL/g），提取溫度為80℃，提取時(shí)間為1.5h，此條件下，枸骨果實(shí)多糖提取率為29.12%。由試驗(yàn)驗(yàn)證得提取率為28.84%，多糖提取率實(shí)際值比理論值小0.96%，響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨果實(shí)多糖提取率工藝參數(shù)可靠有效。