程楊，戰(zhàn)虎，龐泉

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津市食品研究所有限公司，天津301609；3.天津市食品安全檢測(cè)技術(shù)研究院，天津300308）

SOD是超氧化物歧化酶（super oxide dismutase）的英文縮寫，又名為肝蛋白，是一種源自生命體的活性物質(zhì)[1]。SOD屬于金屬酶范疇，按其結(jié)合的金屬離子來區(qū)分可分為三類：第一類含有銅和鋅，稱為Cu、Zn-SOD，也是最常見的一種，顏色呈藍(lán)綠色，主要存在于真核生物細(xì)胞中。第二類含有錳，故稱為Mn-SOD，顏色呈粉紅色，主要存在于原核生物和真核生物的線粒體中。第三類含有鐵，稱為Fe-SOD，顏色呈黃褐色，主要存在于原核生物及某些植物葉綠體中[2]。

由于超氧化物歧化酶廣泛存在于各類生物體中，能使生物體內(nèi)超氧自由基（O2-·）發(fā)生歧化反應(yīng)，成為生物體內(nèi)O2-·的天然消除劑，可對(duì)生物體細(xì)胞起到保護(hù)作用。因此，SOD在幫助生物體防御O2-·的毒性、抗衰老、消炎甚至預(yù)防腫瘤等方面起著重要的生理作用。這使得SOD近年來被廣泛應(yīng)用到日用品，食品，醫(yī)療等方面。在我國(guó)，關(guān)于SOD研究應(yīng)用的深度和廣度已居酶類生化制劑的首位[3-4]。

隨著對(duì)SOD的深入研究，如今SOD的提取來源也相當(dāng)豐富，目前比較常見的是從植物中、微生物中、動(dòng)物源性食品中提取SOD。本研究對(duì)木瓜、酵母菌、牛奶中提取到的SOD進(jìn)行了穩(wěn)定性考察并對(duì)SOD粗提物進(jìn)行修飾。

1 材料和方法

1.1 材料與主要試劑

新鮮牛奶：天津市海河乳業(yè)有限公司；木瓜（湖北常陽產(chǎn)）：市售；酵母菌：天津市啤酒廠；三羥甲基氨基甲烷（Tris）：美國(guó)sigma公司；鹽酸：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；無水乙醇、磷酸二氫鉀：天津市化學(xué)試劑一廠；三氯甲烷、異丙醇、丙酮：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；月桂酸：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；氯化亞砜：天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；小牛血清蛋白：羅氏制藥有限公司；戊二醛：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)；殼聚糖：南凱博化工產(chǎn)品有限公司；甘氨酸：河北華陽生物科技有限公司；鄰苯三酚：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，以上試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二級(jí)實(shí)驗(yàn)水。

1.2 設(shè)備與主要儀器

GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；AB265-S型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同原料中SOD的提取工藝

1.3.1.1 牛奶中SOD的提取工藝[5]

新鮮牛奶→加入無水乙醇→一次提取→離心分離→二次提取→離心分離上清液濃縮→冷凍干燥→粗酶液。

1.3.1.2 木瓜中SOD的提取工藝[6]

稱取新鮮木瓜→用粉碎機(jī)打碎→加入0.1 mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液攪拌均勻浸提2 h→離心→向提取液中加入三氯甲烷-氯仿充分混勻→粗酶液。

1.3.1.3 酵母菌中SOD的提取工藝[7]

向酵母泥加入異丙醇浸泡2 h→抽濾出異丙醇→加入50 mmol/L pH 7.0的磷酸鉀緩沖液攪拌后靜置2 h→離心后除去菌體→用HCl調(diào)節(jié)pH值→加入丙酮萃取→粗酶液。

1.3.2 SOD酶活力測(cè)定方法[8]

A液的配置：pH8.20的0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖溶液（內(nèi)含 1 mmol/L EDTA·2Na）。稱取1.211 4 g Tris和37.2 mg EDTA·2Na溶于62.4 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液中，用蒸餾水定容至100 mL。

B液的配置：4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液。稱取鄰苯三酚（A.R）56.7 mg溶于少量10 mmol/L鹽酸溶液，并定容至100 mL。

稱取0.089 6 g（精確到0.000 1 g）修飾后的SOD提取物，將其用蒸餾水稀釋至10 mL，在離心機(jī)中于4 000 r/min離心。取離心后的上清液1.0 mL用蒸餾水定容到250 mL，備用。

在紫外-可見分光光度計(jì)上于320 nm下測(cè)定空白試劑1 min后的吸光變化值，記做△A320（min-1）。空白試劑的△A320（min-1）應(yīng)為0.060左右。本試驗(yàn)測(cè)得空白試劑的A320為0.0894，1分鐘后的A320為0.1502，則空白試劑的△A320（min-1）為0.060 8，滿足試驗(yàn)要求，可繼續(xù)測(cè)定樣品。

1.3.3 SOD蛋白的修飾方法

為了增強(qiáng)SOD的穩(wěn)定性，本研究選擇3種不同的修飾劑對(duì)所提取的3種SOD進(jìn)行修飾，通過測(cè)定修飾后SOD剩余酶活性來確定修飾率，最終選擇出3種SOD合適的修飾方法[8]。修飾劑分別為月桂酸、牛血清白蛋白、殼聚糖。

1.3.3.1 月桂酸修飾SOD方法

在通風(fēng)櫥內(nèi)安裝回流裝置，使月桂酸和氯化亞砜在75℃的水浴鍋中反應(yīng)2 h，后在90℃～95℃水浴中反應(yīng)2 h。將反應(yīng)物分餾、減壓，除去過量的氯化亞砜，收集146℃～150℃餾分物月桂酰氯。

準(zhǔn)確稱取SOD凍干粉0.5 g，溶于pH8.0的0.002 mol/L磷酸鹽緩沖液中。緩慢加入上述餾分物月桂酰氯，同時(shí)，加入0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值，立即將水浴升溫至42℃攪拌1 h，收集。冷卻后加入1倍體積的冷丙酮，離心后收集沉淀物并將其溶于適量蒸餾水中，再次離心，取上清液，透析后凍干，即得月桂酸-SOD。

1.3.3.2 牛血清白蛋白修飾SOD方法

準(zhǔn)確稱取SOD凍干粉0.5g，溶于pH8.0、0.005 mol/L的磷酸緩沖溶液中。稱取牛血清白蛋白0.5 g與SOD凍干粉混合均勻，置于冰浴中，緩慢加入25%戊二醛，放置1 h，加入甘氨酸20 mg使反應(yīng)中止。透析凍干即得牛血清白蛋白修飾SOD。

1.3.3.3 殼聚糖修飾SOD的方法

將0.08 g納米磁性Fe3O4加入100 mL去離子水中超聲，再加入10 mL 0.75 mol/mL的NaOH溶液，充分?jǐn)嚢?；?.16 g殼聚糖加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液使殼聚糖溶解，再將殼聚糖溶液滴加到上述Fe3O4的NaOH溶液中。

稱取0.2 g制備后的殼聚糖，用0.1 mol/L pH 7.8的磷酸鹽緩沖液溶脹。將0.1 g的SOD凍干粉和0.2 g溶脹的殼聚糖加入到40 mLpH=7.5磷酸鹽緩沖液中，并滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛0.2 mL，在恒溫?fù)u床中于20℃振蕩120 min，用磁鐵將固定化的SOD沉淀，傾出上清液，即得殼聚糖修飾的SOD[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 考察不同原料中提取的SOD的穩(wěn)定性

對(duì)上述3種原料中提取的SOD的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，主要考察pH值穩(wěn)定性、不同溫度下的穩(wěn)定性、外源性試劑穩(wěn)定性3個(gè)方面。

2.1.1 pH值穩(wěn)定性

將 SOD 酶分別置于 pH3、4.5、6、7.5、9、10.5、12 不同的pH值下，分別于60 min后測(cè)定它們的酶活力。pH值穩(wěn)定性見圖1。

圖1 3種不同來源SOD的pH值穩(wěn)定性Fig.1 pH stability of three SOD

通過考察，pH7～8之間時(shí)3種SOD活力保存良好，3種SOD蛋白的活力殘留率都可以保持在88%以上。當(dāng)pH值偏酸性時(shí)，SOD的活力會(huì)隨著pH值的升高而開始增加；在堿性pH值范圍內(nèi)時(shí)，SOD活力隨著堿性的增強(qiáng)而降低，在考察中發(fā)現(xiàn)牛奶中提取的SOD的整體活力保存最好，酵母中的SOD活性次之，而木瓜中SOD的整體活力保存最差。

2.1.2 不同溫度下SOD的穩(wěn)定性

將 SOD 酶液分別于 25、37、50、60、80 ℃下保存24 h后，測(cè)定它們的酶活力。不同溫度下SOD蛋白的穩(wěn)定性見圖2。

圖2 三種不同來源SOD蛋白的熱穩(wěn)定性Fig.2 Heat stability of three SOD proteins

通過考察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為25℃時(shí)3種不同來源的SOD的酶活力均達(dá)到最高，隨著溫度的升高，3種SOD酶的活力開始下降，當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，3種SOD酶徹底失活。牛奶中提取的SOD酶在溫度低于50℃時(shí)均表現(xiàn)出較穩(wěn)定的狀態(tài)，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)其酶活性開始大幅度衰減，溫度高達(dá)80℃時(shí)，其中的酶活性基本為零。3種SOD中，牛奶中SOD酶活力保存較好，木瓜中提取的SOD次之，酵母中SOD的活力保持最差。

2.1.3 外源試劑耐受性

SOD酶作為活性物質(zhì)對(duì)于不同試劑的耐受性存在著較大的差異，此次選擇SOD提取工藝中常用的67%的甲醇、67%的乙腈提取試劑，以及1 mol/L鹽酸胍、3 mol/L尿素和50 mmol/L雙氧水等常用緩沖劑作為此次考察的外源試劑。SOD蛋白對(duì)外源試劑的耐受性見圖3。

圖3 三種不同來源SOD的對(duì)外源試劑的耐受性Fig.3 Acitivty rate of three SOD

木瓜中SOD對(duì)67%甲醇和67%的乙腈的耐受性表現(xiàn)較好，分別為84%和65%，但其對(duì)3 mol/L尿素、1 mol/L鹽酸胍和50 mmol/L雙氧水3種試劑的耐受性較差；此次考察中酵母菌對(duì)5種外源試劑的耐受性均在40%以下；而牛奶中的SOD對(duì)外源試劑的耐受性表現(xiàn)較好，其SOD的活力均保持在80%左右。根據(jù)測(cè)試結(jié)果顯示，牛奶中SOD對(duì)5種外源試劑的耐受性明顯優(yōu)于木瓜和酵母菌中提取的SOD。

通過考察不同來源SOD蛋白在上述條件下的穩(wěn)定性，得出結(jié)論：牛奶中的SOD蛋白在不同pH值、不同溫度及對(duì)外源性試劑的干擾方面的穩(wěn)定性較為理想。故選擇牛奶作為提取原料進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)從其中提取的SOD做進(jìn)一步修飾，提高其穩(wěn)定性。

2.2 SOD酶活力的測(cè)定結(jié)果

針對(duì)牛奶中提取的SOD我們采用經(jīng)典鄰苯三酚自氧化法測(cè)定其SOD活性，SOD酶活力的測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法規(guī)定每分鐘反應(yīng)液中SOD抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時(shí)為一個(gè)SOD活力單位[10]。

在紫外-可見分光光度計(jì)上采用波長(zhǎng)掃描程序，在波長(zhǎng)200 nm～600 nm范圍內(nèi)對(duì)提取物進(jìn)行掃描，檢測(cè)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物波長(zhǎng)吸收規(guī)律。利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)得的SOD紫外吸收光譜圖，見圖4。如圖4所示，牛奶中SOD的最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)在319 nm處，這與GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定》[10]中的試驗(yàn)條件320 nm相符，故本試驗(yàn)采用320 nm為試驗(yàn)的測(cè)定的波長(zhǎng)。

圖4 SOD的紫外吸收光譜圖Fig.4 UV absorption spectrum of SOD

取數(shù)支10 mL離心管，向離心管中加入A液2.35 mL、B液0.15 mL、一定量的蒸餾水及樣液，整個(gè)試驗(yàn)過程中A液均應(yīng)恒溫于25℃。試驗(yàn)數(shù)據(jù)及相應(yīng)的△A320（min-1）值見表1所示。

表1 鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定加樣表Table1 Pyrogallot autoxidation rate test volume table

根據(jù)上表試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)稀釋后的酶液加入量為90 μL時(shí)，△A320（min-1）的值為0.029 9，近似于50%的自氧化速率空白值，滿足試驗(yàn)要求。將酶加入量為90 μL時(shí)的相應(yīng)數(shù)值代入公式。根據(jù)公式：

式中：A320為鄰苯三酚的自氧化速率；A'320為樣液抑制鄰苯三酚自氧化速率；V1為反應(yīng)液總體積，本次實(shí)驗(yàn)中為4.5 mL；V為加入樣液的體積，本次實(shí)驗(yàn)中為0.2 mL；D為樣液稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量。

最終計(jì)算出樣品中SOD酶活性的結(jié)果為116 608 U/g。

2.3 3種修飾方法的比較

測(cè)定上述3種修飾劑后的SOD吸光值，并計(jì)算修飾率。向上述3種修飾酶中加入1 mL 4%NaHCO3，1 mL 10%十二烷基硫酸鈉，充分溶解20 min；加入1 mL 0.1%三硝基苯磺酸，在40℃的水浴中保溫2 h，用0.5 mL，1 mol/L HCl終止反應(yīng)，利用紫外-可見分光光度計(jì)于350 nm處測(cè)定吸光值[11]。修飾結(jié)果見表2。

表2 修飾后SOD的剩余酶活力Table2 The left enzyme activity after modification

由表2可以得出，針對(duì)牛奶中提取的SOD考察了牛血清白蛋白、月桂酸、殼聚糖對(duì)其的修飾作用，月桂酸修飾SOD的得率最高。根據(jù)修飾后SOD的剩余活性和修飾率，本研究最終選定利用月桂酸修飾牛奶中提取的SOD。

3 結(jié)論

本研究考察了牛奶、木瓜及酵母菌3種不同來源的SOD，通過對(duì)它們穩(wěn)定性的研究，最終確定以新鮮牛奶為原料，用乙醇作為提取試劑，所得SOD的酶活力為116 608 U/g。因SOD具有生物活性，為使其性質(zhì)穩(wěn)定，更適合其在各種環(huán)境下發(fā)揮作用。本研究考察了月桂酸、牛血清白蛋白、殼聚糖3種不同的修飾劑對(duì)其的修飾效果，最終確定用月桂酸對(duì)牛奶中SOD進(jìn)行修飾，采用經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化法測(cè)得修飾后的SOD的酶活力為115 127 U/g。