黃仁術(shù)，汪瑩，陳坤，項(xiàng)學(xué)偉，徐興苗

摘要：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用響應(yīng)面分析優(yōu)化■荷多糖的最佳提取工藝；對(duì)此工藝下的提取液進(jìn)行濃縮，通過(guò)牛津杯法和二倍稀釋法探討其抑菌活性。結(jié)果表明：在優(yōu)化工藝條件處理溫度91.67℃、液料比25.0mL/g、處理時(shí)間1.5h時(shí)，■荷多糖得率為10.15%，與預(yù)測(cè)值9.94%的相對(duì)誤差僅2.07%；■荷多糖對(duì)大腸桿菌、黑曲霉和釀酒酵母沒有體外抑制作用，但對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有體外抑制作用，其MIC分別為0.4930mg/mL、1.9722mg/mL，MBC分別為1.9722mg/mL、7.8886mg/mL。■荷多糖可作為一種新型抗菌藥物開發(fā)，其提取工藝可用響應(yīng)面法進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

關(guān)鍵詞：多糖；■荷；響應(yīng)面；提取工藝；體外抑菌

項(xiàng)目基金：安徽省高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2018A0413）；安徽省林業(yè)科技攻關(guān)團(tuán)隊(duì)（2017062）；安徽省林業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2018061）；安徽省2018年度重點(diǎn)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：1804g07020182）

中圖分類號(hào)： R931.71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.14.029

■荷（Zingiber mioga （Thunb.） Rosc. ），又名陽(yáng)荷、茗荷、觀音花、蓮花姜、野姜等，屬藥食兩用的姜科多年生草本植物，廣泛分布我國(guó)南方地區(qū)。而植物多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)造血功能等多種功效。但目前有關(guān)■荷多糖的研究仍比較少見，僅譚志偉等研究了傳統(tǒng)的熱浸提工藝和提取物的抗氧化性[1，2]，陳仕學(xué)等研究了微波輔助提取工藝[3]，邱嵐等研究了超聲輔助提取工藝[4]，朱培蕾等研究了■荷水溶性多糖的理化性質(zhì)及其體外抗氧化活性[5]。本文在響應(yīng)面法優(yōu)化■荷多糖提取工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)其抗菌活性進(jìn)行研究，以期為■荷資源的有效開發(fā)和新型抗菌藥物的獲得提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

HH恒溫水浴鍋（金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠），SHZ-D循環(huán)水真空泵（鄭州予華儀器有限公司），H2050R臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），ZD-85氣浴恒溫振蕩器（金壇市杰瑞爾有限公司），DHP-9272數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司），YX-450電熱蒸汽壓力消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司），SW-CJ-1C潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）等。硫酸、苯酚等均為分析純（西隴化工股份有限公司）。■荷從大別山區(qū)采集。實(shí)驗(yàn)菌株包括以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）為代表的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，以大腸桿菌（Escherichia coli）為代表的革蘭陰性細(xì)菌，以黑曲霉（Aspergillus niger）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為代表的真菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ■荷多糖的測(cè)定 根據(jù)苯酚-硫酸法，設(shè)置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度梯度，建立其吸光度與葡萄糖質(zhì)量M（μg）的線性關(guān)系，從而計(jì)算■荷多糖質(zhì)量[6]。

1.2.2 確定單因素范圍

（1） 處理溫度（X1）：分別稱取3.0g過(guò)80目篩的■荷粉末，計(jì)5組3個(gè)重復(fù)共15份；每份用45mL蒸餾水溶于三角瓶后，各組分別置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的水浴中浸提2h；提取液4000轉(zhuǎn)速離心10min，Sevag法脫蛋白后濾液50mL容量瓶定容；取100uL提取液稀釋100倍，稀釋提取液，取其1mL按苯酚-硫酸法測(cè)定多糖濃度，以確定處理溫度。

（2）液料比（X2）：同上，按10mL/g的液料比梯度，確定15～45mL/g范圍內(nèi)的液料比。

（3）處理時(shí)間（X3）：同上，按0.5h的時(shí)間梯度，確定1～3h范圍內(nèi)的處理時(shí)間。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化 響應(yīng)面采用Design-Expert.8.0.6軟件設(shè)計(jì)，處理溫度（X1）、液料比（X2）和處理時(shí)間（X3）為自變量，■荷多糖提取得率（Y）為響應(yīng)值。

1.2.4 體外抑菌 純化供試菌種制成菌懸液備用?！龊啥嗵菨饪s物體外抑菌效果以牛津杯法測(cè)定；■荷多糖最低抑菌濃度（MIC）以二倍稀釋法測(cè)定，對(duì)有抑菌效果的二倍稀釋液移種到培養(yǎng)基上，根據(jù)培養(yǎng)皿中菌落生長(zhǎng)情況測(cè)定■荷多糖最小殺菌濃度（MBC）[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ■荷多糖的測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，吸光度A與多糖質(zhì)量M的線性關(guān)系為A=0.007M+0.0038，R=0.9998，相關(guān)系數(shù)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)高于0.99的要求，可作為測(cè)定依據(jù)[8]。

2.2 確定單因素范圍

表1 不同處理溫度對(duì)提取效果的影響

注：dfA=4，dfe=10；SSA=10.5976，SSe=0.9003；Sx=0.1732；**表示組間差異極顯著。

2.2.1 處理溫度 由表1的SSR法檢驗(yàn)可見，在80℃～100℃時(shí)，■荷多糖的得率最高，與其他各組差異極顯著（P<0.01）；但在80℃～100℃之間差異不顯著（P>0.01），響應(yīng)面法可進(jìn)一步優(yōu)化篩選此溫度范圍?？紤]能源消耗，確定其他單因素范圍時(shí)可暫定80℃。

2.2.2 液料比 由表2的SSR法檢驗(yàn)可見，隨著液料比的進(jìn)一步提高，■荷多糖的得率極顯著降低（P<0.01）；但在15～25mL/g時(shí)差異不顯著（P>0.01），響應(yīng)面法可進(jìn)一步于5～25mL/g區(qū)間篩選液料比范圍，確定其他單因素范圍時(shí)可暫定液料比為15mL/g。

表2 不同液料比對(duì)提取效果的影響

注：dfA=3，dfe=8；SSA=2.2840，SSe=0.8691；Sx=0.1903；**表示組間差異極顯著。

2.2.3 處理時(shí)間篩選試驗(yàn) 由表3的SSR法檢驗(yàn)可見，隨著處理時(shí)間的增加或減少，■荷多糖得率都會(huì)極顯著性降低（P<0.01），■荷多糖得率最高時(shí)的處理時(shí)間為2h，響應(yīng)面法篩選范圍可選擇1.5～2.5h區(qū)間。

表3 不同處理時(shí)間對(duì)提取效果的影響

注：dfA=4，dfe=10；SSA=16.2721，SSe=0.6024；Sx=0.1417；**表示組間差異極顯著，*表示顯著。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 回歸方程與統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表4，經(jīng)二次回歸分析得模型方程：Y=-44.16144+1.41778X1-0.050725X2-13.3595X3+0.00115X1X2

-0.0485X1X3-0.011X2X3-0.0074925X12+0.0046325X22+4.423X32。

表4 ■荷多糖提取響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)數(shù)字模型方差分析結(jié)果看（表5）：模型的F=33.28、（Prob>F）<0.0001，表明該模型顯著而具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型失擬項(xiàng)（Prob>F）=0.0564>0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，實(shí)驗(yàn)和模型擬合程度好；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9772>0.95，說(shuō)明模型擬合度好而具有高可信度；變異系數(shù)（CV）=4.73%，信噪比22.552>4，表明模型方程能客觀反映實(shí)驗(yàn)值?？梢姟龊啥嗵翘崛」に嚳梢詰{該模型來(lái)預(yù)測(cè)。在模型方程中，X2偏回歸系數(shù)顯著（P<0.05），說(shuō)明液料比對(duì)■荷多糖提取的效應(yīng)影響顯著。

表5 ■荷多糖提取工藝優(yōu)化數(shù)學(xué)模型方差分析

2.3.2 ■荷多糖提取的響應(yīng)面分析

綜合圖1、圖2、圖3可見：隨著料液比的增加■荷多糖提取得率提高；隨著處理溫度的上升■荷多糖提取得率先提高后降低；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)■荷多糖提取得率先降低后提高。三者之間未見交互效應(yīng)。

2.3.3 試驗(yàn)驗(yàn)證

經(jīng)軟件優(yōu)化計(jì)算，在處理溫度91.67℃、液料比25.0mL/g、處理時(shí)間1.5h時(shí)，■荷多糖的提取得率最大，達(dá)到9.94%。此工藝條件下驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)，■荷多糖實(shí)際提取得率10.15%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差僅2.07%。

2.4 體外抑菌試驗(yàn)

2.4.1 牛津杯法測(cè)定■荷多糖抑菌效果

由圖4、圖5可知，■荷多糖濃縮液（7.8886mg/mL）對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有明顯的體外抑制作用；但對(duì)大腸桿菌、黑曲霉和釀酒酵母未見體外抑制作用。其中，■荷多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑為15.5mm；對(duì)枯草芽孢桿菌的平均抑菌圈直徑為9.6mm。

2.4.2 ■荷多糖的MIC、MBC測(cè)定（圖6，圖7）

由圖6可見，■荷多糖的濃縮液在第4支試管，即1/16倍稀釋前，試管中的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)受抑制、培養(yǎng)液清亮，之后金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)、培養(yǎng)液混濁。各試管稀釋液轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)皿后，至第2支試管，即1/4倍稀釋液在培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)小于5個(gè)，而第3支試管開始，即1/8倍稀釋液轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)皿后，菌落數(shù)多于5個(gè)。說(shuō)明■荷多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為其濃縮液的1/16倍稀釋液，即0.4930mg/mL；MBC為其濃縮液的1/4倍稀釋液，即1.9722mg/mL。

由圖7可見，■荷多糖的濃縮液在第2支試管，即1/4倍稀釋前，試管中的枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)受抑制、培養(yǎng)液清亮，之后金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)、培養(yǎng)液混濁。各試管稀釋液轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)皿后，第1支試管，即1/2倍稀釋液在培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)就多于5個(gè)，僅濃縮液原液的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿上未見菌落生長(zhǎng)。說(shuō)明■荷多糖對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為其濃縮液的1/4倍稀釋液，即1.9722mg/mL；MBC為其濃縮液原液，即7.8886mg/mL。

3 結(jié)論

本研究以■荷為原料，運(yùn)用響應(yīng)面法建立■荷多糖提取工藝的數(shù)學(xué)回歸模型為：Y=-44.16144+1.41778X1-0.050725X2-

13.3595X3+0.00115X1X2-0.0485X1X3-0.011X2X3-0.0074925X12+

0.0046325X22+4.423X32。通過(guò)模型得知■荷多糖的最佳工藝為處理溫度91.67℃、液料比25.0mL/g、處理時(shí)間1.5h，此工藝時(shí)■荷多糖實(shí)際提取得率達(dá)到10.15%，與預(yù)測(cè)值9.94%的相對(duì)誤差僅2.07%，表明響應(yīng)面法適用于對(duì)■荷多糖提取得率進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化與回歸分析。此工藝條件下提取的■荷多糖進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果牛津杯法表明■荷多糖濃縮液在7.8886mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有體外抑制作用，對(duì)大腸桿菌、黑曲霉和釀酒酵母沒有體外抑制作用；■荷多糖對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC分別為0.4930mg/mL、1.9722mg/mL，MBC分別為1.9722mg/mL、7.8886mg/mL。

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作者簡(jiǎn)介：黃仁術(shù)，碩士，副教授，研究方向：天然活性物質(zhì)研究。