李 娜，李洪林，尹利榮

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科，天津300211）

宮頸癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌，居世界第二位，嚴重威脅婦女的生命健康[1]。眾所周知，宮頸癌由宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN) 發(fā)展而來，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個漫長的過程，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）即為宮頸癌前病變[2]，從CIN發(fā)展到宮頸癌大約是10年的時間。早期宮頸癌患者5年治愈率高達90%，因此，CIN的早期診斷治療對降低宮頸癌的發(fā)生率和死亡率至關(guān)重要。目前，宮頸癌的發(fā)病機制越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，成為研究熱點。大量研究表明，人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因，特別是高危型HPV感染。高危型HPV的E6、E7蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。超過90%的浸潤性宮頸癌都能檢測到HPV感染，甚至95%的癌前病變患者攜帶HPV，HPV感染是宮頸癌的主要致病因素，但只有很少病例最終發(fā)展到浸潤性宮頸癌。因此，HPV感染雖是細胞惡性轉(zhuǎn)化的重要致病因素，但還有其它致病因素存在，才能最終發(fā)展到宮頸癌。近年來發(fā)現(xiàn)，Hippo信號通路與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，YAP作為該通路重要的效應(yīng)因子可以誘導(dǎo)細胞增殖并抑制凋亡。但目前在宮頸癌中關(guān)于HPV感染與YAP表達的相關(guān)研究報道較少，對于兩者在宮頸癌的發(fā)生中是否存在協(xié)同作用尚不清楚，因此本文通過研究宮頸病變中HPV E6/E7 mRNA與YAP的表達情況，探討兩者在宮頸癌發(fā)生中的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2014年6月-2015年6月在我院婦科就診后行手術(shù)治療的患者124例，其中將行宮頸錐切病理診斷為CINII-III的45例患者歸為CIN組，將病理診斷為宮頸癌并行廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的43例患者歸為宮頸癌組。按WHO組織病理學(xué)分類，其中鱗癌29例，腺癌14例；宮頸癌分期采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2009年的診斷標(biāo)準，其中Ⅰ期25例，Ⅱ期18例；按腫瘤分化程度進行分級：高分化16例，中分化18例，低分化9例；盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：有轉(zhuǎn)移22例，無轉(zhuǎn)移21例。對照組36例選自同時間段在我院因子宮良性病變（子宮肌瘤以及腺肌癥后行宮頸活檢的病例）行子宮全切術(shù)的正常宮頸標(biāo)本，術(shù)后經(jīng)病理證實無宮頸病變。對照組年齡26～56歲，平均年齡為（43.58±8.476）歲，中位年齡 45歲；試驗組年齡18～72歲，平均年齡（46.65±11.623）歲，中位年齡46歲，兩組年齡比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05)。所有病例排除生殖道急性炎癥，排除合并其他惡性腫瘤以及已行放化療的宮頸癌組織標(biāo)本，臨床及病理資料完整。

1.2 試劑及儀器 宮頸穩(wěn)態(tài)試劑盒及96孔檢測板[科蒂亞（新鄉(xiāng)）生物技術(shù)有限公司]；Quanti VirusTM臺式冷光儀；恒溫箱（型號QS071）；兔抗人YAP多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology）；生物素標(biāo)記的抗兔IgG（二抗）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；SP試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 HPVE6/E7 mRNA的檢測 （1）標(biāo)本采集：使用液基細胞學(xué)Autocyteprep系統(tǒng)專用刷插入受檢者子宮頸旋轉(zhuǎn)8～10圈，收集宮頸口及頸管脫落上皮細胞，然后將刷頭部放入裝有CytoRich保存液的小瓶內(nèi)供HPVE6/E7 mRNA檢測。（2）實驗步驟：將液基細胞學(xué)標(biāo)本放入離心管水平離心2次（3000r/min，5 min），使標(biāo)本同質(zhì)化。加入600 μL細胞裂解液和5 μL蛋白酶K，吹打混勻，放入65℃恒溫箱1 h，中間取出標(biāo)本管振蕩2～3次，使細胞充分裂解，待測。按照宮頸穩(wěn)態(tài)試劑盒說明書操作及配置相關(guān)溶液并布板，其中陽性對照液，空白對照液均做復(fù)孔。經(jīng)過信號放大，加入標(biāo)記熒光物質(zhì)的底物后，在冷光儀上檢測。檢測結(jié)果為光子數(shù)，經(jīng)計算軟件轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)。本研究以mRNA拷貝數(shù)≥1 copy/mL為陽性。

1.3.2 YAP的檢測 通過預(yù)實驗取最佳一抗工作濃度1：200進行試驗，按常規(guī)步驟通過免疫組化SP法檢測正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變和宮頸癌組織中YAP的表達情況。所有操作步驟依據(jù)產(chǎn)品說明書進行，二抗為生物素標(biāo)記的抗兔IgG，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，顯微鏡下觀察分析結(jié)果。已知陽性組織片做陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。每例常規(guī)進行HE染色。

1.4 結(jié)果判讀 所有切片的觀察均經(jīng)2～3名病理科醫(yī)生獨立在光鏡下完成。YAP免疫組化染色結(jié)果判定：以胞漿和胞核中出現(xiàn)棕黃色顆?；蛘咦睾稚w粒為陽性。每例均隨機觀察5個高倍視野（×400），用半定量積分法判斷結(jié)果，染色陽性細胞所占比例按以下標(biāo)準計分：陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為 1分，26%～50%為 2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度計分以細胞顯色反應(yīng)程度計分：無著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；最后將陽性細胞所占的百分比分值和染色強度分值相乘為結(jié)果：0～2分為陰性，3分及以上為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗數(shù)據(jù)資料均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，應(yīng)用χ2檢驗分析HPV E6/E7 mRNA和YAP在不同宮頸組織中的表達情況，并分析YAP的表達與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，采用Spearman等級相關(guān)檢驗分析HPV E6/E7 mRNA與YAP的相關(guān)性，數(shù)據(jù)以檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA的檢出情況 HPV E6/E7 mRNA的陽性檢出率隨著宮頸病變程度的升高而逐級升高（正常組16.67%、CIN組82.22%、宮頸癌組88.37%），3組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。正常組與CIN組、正常組與宮頸癌組組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CIN組和宮頸癌組，組間無明顯差異（P＞0.05），見表1。

2.2 不同宮頸組織中YAP的表達情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，YAP表達以胞核為主，在胞質(zhì)中部分表達。YAP在正常組中的表達明顯低于CIN組及宮頸癌組，3 組之間比較，χ2=66.193，P＜0.001，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。再兩兩之間進行比較，發(fā)現(xiàn)正常組與宮頸癌組、正常組與CIN組兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但CIN組與宮頸癌組之間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖1。

表1 各組HPV E6/E7 mRNA檢出情況Tab 1 The positive rate of HPV E6/E7 mRNA in each group

表2 各組YAP的表達情況Tab 2 The expression of YAP in each group

圖1 YAP在正常宮頸、CINII-III、宮頸鱗癌組織中的表達（免疫組化法，×400）Fig 1 Expression of YAP in normal cervical tissues,CINII-III and cervical squamous cell carcinoma（IHC，×400）

2.3 YAP的表達與宮頸癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 在宮頸癌組織中，YAP在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），而與宮頸癌的臨床分期（I、II期）、組織學(xué)分級以及組織學(xué)類型無相關(guān)性（P＞0.05)，見表 3。

2.4 HPV E6/E7 mRNA與YAP表達的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，宮頸癌組織HPV E6/E7 mRNA和YAP表達具有正相關(guān)性，r=0.383，P=0.011，見表 4。

表3 YAP的表達與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 3 The relationship between the expression of YAP and clinical pathological parameters of cervical carcinoma

表4 HPV E6/E7 mRNA與YAP在宮頸癌中表達的相關(guān)性Tab 4 The correlation between the expression of HPV E6/E7 mRNA andYAPincervialcarcinoma

3 討論

3.1 HPV E6/E7與宮頸病變的關(guān)系 HPV致癌的主要環(huán)節(jié)就是高危型HPV16、18編碼的E6、E7致癌蛋白分別與抑癌基因p53和pRb結(jié)合，使p53通路和Rb通路失活，導(dǎo)致細胞周期調(diào)控異常，引起宮頸癌的發(fā)生。子宮頸的鱗狀上皮和柱狀上皮交界處是HPV的易感部位。HPV感染宿主后，HPV DNA與宿主染色體進行整合。HPV與宿主細胞染色體的整合是宮頸細胞永生化過程中的重要步驟，是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變向?qū)m頸癌惡性進展的一個重要標(biāo)志[3]。由于E2基因不穩(wěn)定，HPV DNA與宿主細胞的整合常引起E2基因的缺失，E6、E7的轉(zhuǎn)化作用受E2的調(diào)控，E2片段缺失可導(dǎo)致E6和E7基因表達失控，通過干擾細胞周期調(diào)節(jié)和有絲分裂，引起細胞轉(zhuǎn)化和癌變發(fā)生。本研究結(jié)果提示，隨著宮頸病變級別的升高，HPV E6/E7 mRNA的陽性檢出率逐級升高，正常組、CIN組、宮頸癌組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示，HPV E6/E7 mRNA 是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。因此，HPV E6/E7 mRNA的檢測，對于及時發(fā)現(xiàn)、干預(yù)宮頸癌的發(fā)展、協(xié)助臨床診斷、指導(dǎo)預(yù)后均具有重要的意義。

3.2 YAP與宮頸病變的關(guān)系 Hippo通路在通過抑制細胞增殖和促進凋亡來調(diào)控器官大小和腫瘤的發(fā)生中起著關(guān)鍵的作用。YAP最初由Sudol[4]于1994年發(fā)現(xiàn)，是一種細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄共激活因子和連接蛋白，參與調(diào)控細胞生長、增殖和凋亡。YAP基因定位于染色體11q22[5]，編碼相對分子量約65kda富脯氨酸的鱗蛋白，被認為是一種有效的致癌基因和Hippo信號通路的核效應(yīng)器，通過增強轉(zhuǎn)錄因子的活性促進基因表達。YAP在正常組織中表達很低，可維持細胞生長、分化、凋亡的穩(wěn)態(tài)平衡。如果任一環(huán)節(jié)突變，惡化的細胞表達過量的YAP，超過正常生理調(diào)控功能，導(dǎo)致YAP在胞質(zhì)內(nèi)異常聚集，并不斷向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，激活下游靶基因，有利于腫瘤的發(fā)展、惡化。大量研究表明，Hippo-YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[6]，許多腫瘤中染色體擴增區(qū)域都含有YAP基因，并且YAP在正常組織和惡性腫瘤中的表達存在明顯差異，多數(shù)癌組織中的表達較對照組明顯升高，并呈上升趨勢。在胰腺癌[7]、胃癌[8]、肝癌[9]及非小細胞肺癌[10]中，YAP 表達量均明顯高于正常組織，說明YAP在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Liu等[11]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測120例鱗狀細胞癌、42例腺癌、22例正常宮頸組織YAP的表達水平，并對細胞質(zhì)與細胞核中YAP的表達單獨分析，發(fā)現(xiàn)YAP在腫瘤中的表達水平明顯高于正常組織。研究證明了YAP在宮頸癌的致癌潛能及其在鱗狀細胞癌和腺癌中的獨特功能。

本實驗結(jié)果顯示：YAP在正常組、CIN組以及宮頸癌組中的表達呈上升趨勢，且差異具有顯著性（P＜0.05），可以推斷出YAP的表達可能參與了宮頸癌的發(fā)生過程，并且YAP有可能在宮頸癌的臨床診斷中具有重要價值。本實驗的結(jié)果和YAP在其他大部分腫瘤中的報道是一致的。在宮頸癌組織中，YAP在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），而與宮頸癌的臨床分期（I、II期）、組織學(xué)分級以及組織學(xué)類型無相關(guān)性（P＞0.05)，提示YAP在宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。YAP可作為判斷宮頸癌生長、浸潤以及轉(zhuǎn)移能力的指標(biāo)，對腫瘤進展的輔助診斷以及預(yù)后評估是非常有幫助的，YAP的表達越高，宮頸癌的惡性侵襲性越強、病情進展越快，說明了YAP的擴增、突變可能促進了宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

3.3 HPV E6/E7 mRNA與YAP的相關(guān)性 研究表明YAP與HPV都與p53家族相關(guān)聯(lián)。P53是一種應(yīng)激激活的轉(zhuǎn)錄因子，防止基因受損細胞的增殖。p53基因是一種調(diào)節(jié)細胞程序性死亡和細胞周期相關(guān)途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，激活細胞周期檢查點和促進細胞衰老，它已被認為是腫瘤抑制的主要參與者。p53損失或失活促使異常細胞克隆擴增，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。高危型HPV的癌蛋白E6和E7通過干擾p53途徑實現(xiàn)宮頸細胞轉(zhuǎn)化和永生化。YAP通過調(diào)節(jié)p53活性來控制轉(zhuǎn)錄。已發(fā)現(xiàn)YAP與p73和p63通過WW結(jié)構(gòu)域和PPPY結(jié)構(gòu)相結(jié)合，p73和p63為p53腫瘤抑制家族的新成員。此外，Xiao等[12]應(yīng)用免疫組化的方法檢測慢性炎癥組、CIN組、宮頸癌組YAP的表達，用HPV基因檢測試劑盒檢測各組HPV的感染率，結(jié)果表明，YAP與HPV檢測相結(jié)合，可以區(qū)別宮頸癌前病變和良性病變。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)YAP可作為宮內(nèi)上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的預(yù)測標(biāo)志物。聯(lián)合檢測HPV和YAP可以提高宮頸病變的診斷率，通過早期干預(yù)從而降低宮頸癌的患病率。