柴春月， 田 龍

(南陽師范學(xué)院， 河南 南陽 473061)

黃孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBurdsall)是白腐菌的一種，具有極強(qiáng)的酵解木質(zhì)素的作用。它屬于擔(dān)子菌綱非褶菌目伏革科顯革菌屬。中國秸稈資源豐富，2015年全國秸稈理論資源量為9.6億t，可收集資源量約為7.6億t。然而大部分秸稈被廢棄或直接焚燒，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[1-2]。秸稈是一種優(yōu)質(zhì)生物質(zhì)能，2 t秸稈能源化的熱值相當(dāng)于1 t標(biāo)準(zhǔn)煤[3]。推廣秸稈能源化利用，可減少煤、石油等化石能源消耗，改善能源結(jié)構(gòu)，減少二氧化碳排放，緩解全球氣候變化等[4]。秸稈可發(fā)酵物質(zhì)含量較高，產(chǎn)沼氣潛力較強(qiáng)，但它的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)是生產(chǎn)沼氣的瓶頸。降解木質(zhì)纖維素的關(guān)鍵是去除木質(zhì)素[5-6]。近年來利用生物法預(yù)處理秸稈成為研究熱點(diǎn)。生物法常用的是白腐菌[7]。Ghost[8]等發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌菌絲體有很強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力。黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)是白腐菌的一種，降解木質(zhì)素能力很強(qiáng)，現(xiàn)已成為用于研究生物質(zhì)利用和自然界有機(jī)污染物生物治理的模式生物。本文用黃孢原毛平革菌對秸稈木質(zhì)纖維素進(jìn)行降解預(yù)處理，研究其對厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的影響，探索小麥秸稈高效產(chǎn)沼氣的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥秸稈：收集于南陽郊區(qū)，洗凈，風(fēng)干，粉碎，保存。經(jīng)測定，其總固體含量(TS)為91.45%，主要成分的含量為：纖維素36.5%，半纖維素28.2%，木質(zhì)素19.6%。菌種：黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心?；A(chǔ)培養(yǎng)液[9]：KH2PO40.20 g· L-1，MgSO4·7H2O 0.05 g·L-1，CaCl20.01 g·L-1和1 mL·L-1無機(jī)鹽溶液，維生素B1100 mg·L-1，吐溫-80 0.05%。無機(jī)鹽溶液[10]：0.50 g·L-1,MnSO4·H2O;0.01 g·L-1，AlK(SO4)2·12 H2O;0.01 g·L-1,H3BO3;0.01 g·L-1,Na2MoO4·2H2O; 0.10 g·L-1,FeSO4·7H2O;0.10 g·L-1,CoCl2·6H2O; 0.10 g·L-1,ZnSO4·7H2O;0.01 g·L-1,CuSO4·5H2O;3.00 g·L-1,MgSO4·7H2O。

厭氧消化試驗(yàn)所用沼液總固體(TS)的含量為4.88%，揮發(fā)性固體(VS)為65.43%，pH值為7.73。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 秸稈的好氧降解試驗(yàn)

將黃孢原毛平革菌在30℃溫度下活化，150 r·min-1轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)7 d后，用滅菌濾紙過濾，滅菌水沖洗3次，至濾紙不再滴水。稱取秸稈40 g于1 000 mL錐形瓶中，按固液比1∶2加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液，自然pH值，加水調(diào)節(jié)含水率至75 %，封口后于120℃下滅菌30 min。冷卻至室溫后以20%的接種量(以濕重計(jì))接種上述過濾得到的菌體，接種后放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，調(diào)節(jié)濕度75 %，好氧條件下，在30℃溫度下培養(yǎng)，分別于10 d，15 d，20 d取樣，測定纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等指標(biāo)。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.2.2 降解產(chǎn)物的厭氧發(fā)酵試驗(yàn)

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)裝置見圖1。以一個容積為2500 mL 的錐形瓶作為發(fā)酵罐，側(cè)壁上共開有兩個出口，上方為氣樣口，下方為液樣口，錐形瓶的開口用玻璃管連接集氣瓶，集氣瓶后連通集液瓶。將發(fā)酵罐置于35℃的水浴鍋中進(jìn)行發(fā)酵。氣體收集瓶容積為2500 mL，采用排水法收集氣體，通過測量排出水的體積獲得沼氣產(chǎn)量。

采用濕發(fā)酵方法：取預(yù)處理10 d，15 d，25 d后發(fā)酵原料(濕料)，加入接種沼液400 g(TS為2.3%)，加水將發(fā)酵物總質(zhì)量調(diào)整至600 g，此時發(fā)酵罐里的TS負(fù)荷均為8%。密封后，35℃±1℃下進(jìn)行厭氧發(fā)酵。對照處理為不加菌體的原料。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1，每個處理做2個重復(fù)。

1.液樣口； 2.氣樣口； 3.恒溫水浴鍋； 4.導(dǎo)氣管； 5.集氣瓶； 6.排水管； 7.集液瓶圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

表1 厭氧發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 測定項(xiàng)目及方法

纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量測定采用范氏法[11-12]；產(chǎn)氣量的測定采用排水集氣法；沼氣中甲烷含量的測定采用GC-9890A氣相色譜儀分析 (TCD檢測器)；干物質(zhì)的測定采用105℃烘24 h差重法；pH值采用雷磁pHS-2F型酸度計(jì)測定；揮發(fā)性脂肪酸的測定采用比色法。

1.2.4 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解過程中秸稈木質(zhì)纖維素含量的變化

由圖2可見，黃孢原毛平革菌對木質(zhì)素、纖維素、半纖維素均有不同程度的降解，對木質(zhì)素的降解較為明顯，接種20 d后，木質(zhì)素含量分別降到7.3%，降解率為62.75%。木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率均隨處理時間延長而增加，20 d后對纖維素的降解率為10.9%，對半纖維素的降解率為17.7%。黃孢原毛平革菌是白腐菌的典型代表，前期實(shí)驗(yàn)表明，黃孢原毛平革菌接種濃度過高而會影響木質(zhì)纖維素的降解效率，過低則會導(dǎo)致其降解效果較差。此外，由于木質(zhì)素的屏障作用被打破，黃孢原毛平革菌對半纖維的降解能力也有了顯著的提高。白腐菌改善了秸稈的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地，有利于釋放包裹在木質(zhì)素和半纖維素中的纖維素，使之變得更容易被消化利用，從而達(dá)到提高秸稈消化率的目的。

圖2 降解過程中木質(zhì)纖維素含量的變化

2.2 秸稈厭氧發(fā)酵的產(chǎn)酸特征

圖3是厭氧發(fā)酵中發(fā)酵液pH值的變化，各處理在反應(yīng)過程中秸稈厭氧發(fā)酵酸化速度很快，pH值均在第2天就達(dá)到最低值，黃孢原毛平革菌預(yù)處理10 d，15 d，20 d各組的最低值分別為7.33，7.36，7.28，對照組的最低值為7.15。各處理組的pH值在達(dá)到最低值后開始回升，第5 天至第30 天穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，隨后顯著下降。

圖3 厭氧發(fā)酵中發(fā)酵液pH值的變化

圖4 是厭氧發(fā)酵中發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸濃度的變化，可以看出，各處理的揮發(fā)性脂肪酸濃度在發(fā)酵第2天達(dá)到最高，其中黃孢原毛平革菌預(yù)處理10 d,15 d,25 d各組的揮發(fā)性脂肪酸最高濃度分別為1380 mg·L-1，1025 mg·L-1,1038 mg·L-1。各處理組的揮發(fā)性脂肪酸濃度達(dá)到最高值后開始下降，在第8天達(dá)到一個較低的穩(wěn)定值，而對照組在第15天才達(dá)到較低穩(wěn)定值，并持續(xù)到發(fā)酵結(jié)束。結(jié)合圖3可以看出，pH值和揮發(fā)性脂肪酸的濃度有著相反的變化趨勢，揮發(fā)性脂肪酸濃度升高時pH值下降。統(tǒng)計(jì)分析可知，揮發(fā)性脂肪酸濃度與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明有機(jī)酸的產(chǎn)生是造成發(fā)酵液中pH值下降的最重要原因。

圖4 厭氧發(fā)酵中發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸濃度的變化

2.3 秸稈厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣特征

2.3.1 日產(chǎn)氣量

從圖5可見，各處理厭氧反應(yīng)期間的日產(chǎn)氣量變化趨勢大致相同，均在3～5 d達(dá)到第1個產(chǎn)氣最高峰，微生物將原料中易利用的成分被快速降解，根據(jù)氣相色譜，甲烷體積分?jǐn)?shù)低于10%，而二氧化碳約為50%，這與此時系統(tǒng)中發(fā)酵型細(xì)菌占優(yōu)勢有關(guān)。第1個產(chǎn)氣高峰之后，產(chǎn)氣量下降且持續(xù)一段時間，在25～27 d達(dá)到第2個產(chǎn)氣高峰，此后一直維持在一個較低的產(chǎn)氣量水平，直至發(fā)酵結(jié)束。根據(jù)氣相色譜測定，發(fā)現(xiàn)自第6天開始，生物燃?xì)庵屑淄榈捏w積分?jǐn)?shù)均高于50%，說明此時已經(jīng)進(jìn)入產(chǎn)甲烷的旺盛期。在整個發(fā)酵過程中，出現(xiàn)第1個峰值的原因可能是由于發(fā)酵初期，黃袍原毛平革菌的營養(yǎng)相對比較豐富，生長繁殖速度快，從而分泌出大量的木聚糖酶，在此期間由于前期木質(zhì)纖維素中不僅纖維素和半纖維素得到了有效降解，木質(zhì)素也有部分被降解;而后期的第2個峰值出現(xiàn)的原因可能與黃抱原毛平革菌的次級代謝有關(guān)，在黃抱原毛平革菌的作用下木質(zhì)素的屏障作用被破壞，有更多的半纖維素可被黃袍原毛平革菌利用。

圖5 厭氧發(fā)酵過程中日產(chǎn)氣量的變化

2.3.2 累積產(chǎn)氣量

對各處理在發(fā)酵期間的產(chǎn)氣進(jìn)行累積計(jì)算，結(jié)果見圖6。圖6顯示，對照組在30 d停止產(chǎn)氣，而白腐菌預(yù)處理10 d，15 d，20 d的處理組則繼續(xù)產(chǎn)氣直至發(fā)酵結(jié)束。由黃孢原毛平革菌預(yù)處理10 d，15 d，累積產(chǎn)氣量分別較對照提高了42%，41%。然而，當(dāng)黃孢原毛平革菌預(yù)處理小麥秸稈超過20 d時，木質(zhì)素、纖維素雖然進(jìn)一步降解，但其累積產(chǎn)氣量下降了37%，這是因?yàn)辄S孢原毛平革菌預(yù)處理秸稈的時間過長，微生物本身生理活動消耗了較多的產(chǎn)沼氣底物，同時，它在分解木質(zhì)素的過程中產(chǎn)生并積累了一些抑制纖維素水解酶活性的代謝產(chǎn)物，從而降低了白腐菌預(yù)處理對沼氣發(fā)酵的促進(jìn)作用。

圖6 厭氧發(fā)酵中累積產(chǎn)氣量的變化

3 結(jié)論

秸稈是典型的木質(zhì)纖維素，利用纖維素之前必須把它從木質(zhì)素和半纖維素包裹中釋放出來，而半纖維素比木質(zhì)素易降解，因此，纖維素的分解關(guān)鍵就在于脫除木質(zhì)素。本文的研究表明，黃孢原毛平革菌對木質(zhì)素、纖維素、半纖維素均有不同程度的降解，對木質(zhì)素的降解較為明顯。

各處理組與對照組的揮發(fā)性脂肪酸含量無顯著性差異。對揮發(fā)性脂肪酸含量與產(chǎn)氣量進(jìn)一步分析，揮發(fā)性脂肪酸的高峰值出現(xiàn)在產(chǎn)氣量增加的前期，這是由于有機(jī)酸的大量積累造成pH值降低，從而影響了產(chǎn)甲烷菌的活性，但揮發(fā)性脂肪酸的積累也為甲烷菌生長繁殖提供了大量的物質(zhì)來源，隨著產(chǎn)甲烷菌活性逐步增加，有機(jī)酸底物隨后被甲烷菌充分利用后形成了產(chǎn)氣高峰。經(jīng)黃孢原毛平革菌處理小麥秸稈后，木質(zhì)素、半纖維素、纖維素等發(fā)生不同程度的降解，提高了秸稈的沼氣產(chǎn)率。