唐 艷，武曉曉,2，劉冰浩，陳傳武，牛 英，鄧崇嶺*

(1 廣西特色作物研究院，廣西柑橘生物學(xué)重點實驗室，廣西桂林541004；2 廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004)

寬皮柑橘是中國栽培分布最廣、資源最豐富的一個柑橘類群，在柑橘演化、分類上具有十分重要的地位。Barrett 等[1]指出，在柑橘亞屬中只有3個真正的種，即枸椽(C.medica)、柚(C.grandis)和寬皮橘(C.reticulata)，其他重要的栽培柑橘種類為雜種起源。20世紀(jì)80 年代前柑橘學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，寬皮柑橘近緣野生種只有印度野橘(C.indica)和立花橘(C.tachibana)2種[2]，而中國是否存在寬皮柑橘的近緣野生種，是國際柑橘學(xué)術(shù)界十分關(guān)注的問題。中國柑橘工作者對此作了大量調(diào)查研究工作。20世紀(jì)50～60年代以來，湖南、廣西等地開展了多次柑橘資源普查，在湖南道縣、宜章縣、江永縣及廣西賀州市(原賀縣)等地先后發(fā)現(xiàn)了道縣野橘、莽山野柑、姑婆山野生皺皮柑和姑婆山野生元橘等野生柑橘，這些野生材料的發(fā)現(xiàn)有利于了解柑橘的起源、親緣關(guān)系和遺傳演化規(guī)律。

廣西地跨北熱帶、南亞熱帶和中亞熱帶，地質(zhì)起源古老，地形地貌十分復(fù)雜，北有南嶺山脈，西臨云貴高原，境內(nèi)六萬大山、九萬大山連綿數(shù)千里，多山多雨的獨特地理環(huán)境孕育了豐富的柑橘種質(zhì)資源。1963～1964年，曾勉及葉蔭民先后在廣西進行柑橘考察時，對賀州市(原賀縣)姑婆山的野橘進行了現(xiàn)場鑒定，暫定名為元橘(SinocitruschuanaTseng)[3]；石健泉于1978年和1984年2次到姑婆山一帶進行考察，對姑婆山野生元橘的分布、生存的生態(tài)環(huán)境以及形態(tài)特征進行了分析[3]；石健泉最后根據(jù)調(diào)查結(jié)果，將姑婆山野生元橘分為皺皮柑和元橘[4]；鄧崇嶺等[5]對姑婆山野生皺皮柑和野生元橘進行了復(fù)查，并從地理分布、生境和形態(tài)特征方面進行了分析，認(rèn)為姑婆山野生皺皮柑和野生元橘可能是柑橘屬中的新類型。

柑橘是世界最重要的經(jīng)濟作物之一，柑橘的分類一直受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,但至今都沒有一個權(quán)威的、完整的柑橘分類系統(tǒng)。植物花粉有其獨特的外形、復(fù)雜的外壁結(jié)構(gòu)和精細(xì)的紋飾，并且在遺傳中具有相對較強的保守性和穩(wěn)定性，這對植物種和品種的鑒定具有重要的意義?；诖?，本研究利用花粉形態(tài)特征對姑婆山野生皺皮柑和野生元橘進行分析，為其遺傳演化、分類地位以及親緣關(guān)系的鑒定提供參考依據(jù)[6]。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

試驗所用的姑婆山野生皺皮柑、姑婆山野生元橘和部分試驗材料的花粉采自廣西特色作物研究院資源圃，其余材料的花粉采自中國農(nóng)科院柑桔研究所(重慶)，共計28份材料(表1)。

于盛花期選擇健壯植株，采集樹冠外圍中上部含苞待放的花蕾，用消過毒的鑷子去掉花瓣和花萼，只留花藥，置于烘箱內(nèi)37 ℃烘24 h以上，將獲得的花粉放置于干燥管中低溫保存。

1.2 測定項目及測定方法

1.2.1花粉電鏡掃描觀察用牙簽挑取少量花粉，均勻撒在粘有導(dǎo)電膠的樣品臺上，用離子濺射儀進行真空噴金鍍膜，置于FEI Quanta 200場發(fā)射環(huán)境掃描電鏡下進行觀察，工作電壓為5 kV,選擇有代表性的清晰視野進行觀察，并拍照保存，800倍觀察花粉的整體效果，6 000倍觀察花粉的極面和赤道面，24 000倍觀察花粉的外壁紋飾特征，并測量極軸長(P)、赤道軸長(E)、網(wǎng)脊寬度(W)以及網(wǎng)眼直徑(D)的大小?；ǚ勖枋鰠⒄誛alker[7]的研究方法。

1.2.2花粉定量特征的測量及統(tǒng)計每份試驗材料隨機選取20?；ǚ哿＿M行相關(guān)數(shù)據(jù)的測量和統(tǒng)計，用SPSS軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；選取赤道軸長、極軸長、網(wǎng)眼直徑、網(wǎng)脊寬度、極軸赤道軸比值和網(wǎng)眼網(wǎng)脊比值共6個定量特征，用NTsys-pc軟件將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進行聚類,聚類單元之間的遺傳距離以平均分類距離計算，聚類圖選用UPGMA法。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉的外形大小

姑婆山野生皺皮柑花粉以單粒形式存在，中等大小，存在4條孔溝，花粉粒形狀為長球形，極軸長度為(35.24±1.94)μm，赤道軸長度為(20.39±1.35)μm，P/E均值為1.73(表1)，極面觀為四裂圓形，赤道面觀為長圓形。姑婆山野生元橘花粉都以單粒形式存在，中等大小，存在4條孔溝，花粉粒形狀為長球形，極軸長度為(30.21±1.14)μm，赤道軸長度為(22.12±1.97)μm，P/E均值為1.37，極面觀為四裂圓形，赤道面觀為長圓形(圖版Ⅰ、圖版Ⅱ)。

2.2 花粉的外壁紋飾

姑婆山野生皺皮柑和姑婆山野生元橘的外壁紋飾均為網(wǎng)狀紋飾，即由凸起的網(wǎng)脊和網(wǎng)眼組成，網(wǎng)眼和保衛(wèi)網(wǎng)眼的一半網(wǎng)脊形成一個網(wǎng)胞。但是兩者網(wǎng)脊的寬窄、網(wǎng)眼的形狀、大小存在差異。姑婆山野生皺皮柑網(wǎng)眼較大，形狀為不規(guī)則圓形或多邊形，網(wǎng)眼直徑為(1.65±0.09)μm，網(wǎng)脊較狹且突出，寬度為(0.51±0.10)μm。姑婆山野生元橘網(wǎng)眼較小，形狀多為圓形或近圓形，網(wǎng)眼直徑為(0.86±0.08)μm，網(wǎng)脊平寬光滑，寬度為(0.47±0.09)μm(圖版Ⅲ)。

2.3 聚類結(jié)果分析

利用NTsys軟件對花粉6個定量特征進行聚類分析，在遺傳距離0.827處，將試驗材料分為9個組群(圖1)

第Ⅰ組為羅浮金柑，單獨成一組；

第Ⅱ組為道縣野橘，單獨成一組，在遺傳距離1.20處，道縣野橘和羅浮金柑聚為一組；

第Ⅲ組為23號枳，是枳屬品種，單獨成一組；

第Ⅳ組包括金刀峽宜昌橙和紅河大翼橙，網(wǎng)眼略大，網(wǎng)脊較窄，網(wǎng)眼不規(guī)則。

第Ⅴ組包括8、11、12、13、14、18、21、25、26、27、28共11個品種，該組材料主要為柑橘屬，其中姑婆山野生元橘在遺傳距離0.07處與岑溪酸橘聚為一組，在遺傳距離0.10處又和印度酸橘聚為一組(圖1)；

第Ⅵ組包括10、16、17、19、20、22、23、24共8個品種，該組主要為橘類。

第Ⅶ組為沙田柚，單獨成一組；

第Ⅷ組包括莽山野柑(尖葉)、莽山野柑(圓葉)，該組品種主要特點為網(wǎng)眼較大，網(wǎng)脊較狹并且突出。其中在遺傳距離0.261處莽山野柑(尖葉)與莽山野柑(圓葉)聚為一組(圖1)，是最特別、最原始的野生柑橘。

第Ⅸ組為姑婆山野生皺皮柑，網(wǎng)眼較莽山野柑小而網(wǎng)脊較寬，且在遺傳距離0.976處與莽山野柑(尖葉)、莽山野柑(圓葉)聚為一組。

3 討 論

姑婆山野生皺皮柑花粉的網(wǎng)眼比較大，網(wǎng)脊狹且突出較高，與莽山野柑尖葉[8]、莽山野柑圓葉的花粉形態(tài)相近，與劉庚峰等[9]對寬皮柑橘野生種花粉形態(tài)研究的結(jié)果一致；柑橘花粉形態(tài)進化途徑通常為：較原始柑橘的花粉均為大型，網(wǎng)眼大，網(wǎng)脊比較窄，較進化的柑橘花粉為小型，網(wǎng)眼小，網(wǎng)脊較寬[9-11]，由花粉形態(tài)相近推測姑婆山野生皺皮柑與莽山野柑一樣可能為柑類的原始種，也可能是柑橘屬中的新類型，這與鄧崇嶺等[5]對廣西賀州姑婆山野生柑橘資源復(fù)核調(diào)查的結(jié)果一致；姑婆山野生皺皮柑在遺傳距離0.92處與莽山野柑尖葉、莽山野柑圓葉聚為一組，說明三者有一定的親緣關(guān)系，結(jié)果與劉冰浩等[12]對廣西地方柑橘資源ISSR分析分子標(biāo)記的結(jié)果一致；王福生等[13]應(yīng)用cpSSR 和EST-SSR 標(biāo)記進行柑橘特異種質(zhì)資源遺傳背景研究中，聚類分析莽山野柑均與元橘聚為一組，經(jīng)過試驗材料的核對，研究中的元橘實為姑婆山野生皺皮柑，因此本研究試驗結(jié)果與此相一致。聚類分析結(jié)果表明，莽山野柑(尖葉)和莽山野柑(圓葉)先聚在一起，然后與姑婆山野生皺皮柑聚為一類，在遺傳距離1.64處才與枳屬、金柑屬及柑橘屬的其他類型聚在一起，具有獨立的、特別的原始性，不屬于柑橘屬中的寬皮柑橘、柚、橙和枸椽等種類，且花粉特征原始，推測莽山野柑(姑婆山野生皺皮柑)應(yīng)該為柑橘屬內(nèi)獨立的一個種，是除枸椽(C.medica)、柚(C.grandis)和寬皮柑橘(C.reticulata)外的第4個真正的種，或者有可能是除枳屬、金柑屬和柑橘屬外的一個獨立屬。與鐘廣炎(未發(fā)表資料)認(rèn)為莽山野柑不應(yīng)當(dāng)視為寬皮柑橘，而應(yīng)該是一個獨立的柑橘屬種的觀點基本一致[14]。也與Guohong Albert Wu等[15]的最新研究結(jié)果基本一致。當(dāng)然，如要明確莽山野柑(姑婆山野生皺皮柑)是一個真正的種或者獨立的屬，則需進一步結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)及基因組學(xué)等的研究加以確定。

表1 試驗材料以及花粉電鏡掃描形態(tài)特征

姑婆山野生元橘的網(wǎng)眼較小，網(wǎng)脊平寬光滑，與岑溪酸橘、印度酸橘的花粉形態(tài)相近，與劉庚峰等[9]

圖1 基于花粉形態(tài)的柑橘資源聚類圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis for citrus germplasm based on pollen morphology

研究寬皮柑橘野生種的花粉形態(tài)認(rèn)為元橘與道縣野橘的花粉形態(tài)比較相近的結(jié)果不一致；石健泉對姑婆山野生元橘進行了調(diào)查，從主要的植物性狀分析，元橘與道縣野橘很相似，認(rèn)為這些性狀可能是出自同源祖先的一群個體[3]；劉冰浩等[12]對廣西地方柑橘資源ISSR分析的聚類顯示，姑婆山野生元橘與道縣野橘、立花橘聚為一組，認(rèn)為姑婆山野生元橘與道縣野橘有一定的親緣關(guān)系。本研究中通過花粉形態(tài)特征比較及聚類分析得出的結(jié)果與以上研究結(jié)果不一致，姑婆山野生元橘與道縣野橘相比，網(wǎng)脊較窄而網(wǎng)眼較大，推測姑婆山野生元橘比道縣野橘更具有原始性，可能是寬皮柑橘區(qū)中最原始的野生類型。而道縣野橘卻演化成為一獨特的種類，能單獨為一組,但在遺傳距離1.20處與羅浮金柑聚為一組，似乎存在某種親緣關(guān)系，有待進一步分析研究。施文格(Swingle W.T)和田中長三郎(Tgozoburo Tanaka)都認(rèn)為立花橘(C.tachibana)是寬皮柑橘近緣野生種，從花粉粒大小、網(wǎng)脊寬度、網(wǎng)眼直徑分析結(jié)果表明：姑婆山野生元橘比立花橘要更原始。

柑橘大多數(shù)種是無融合生殖的，根據(jù)花粉對柑橘進行分類具有更重要的意義，花粉大小、網(wǎng)眼大小、網(wǎng)脊?fàn)顩r是區(qū)分柑橘分類群的重要特征[16]?；ǚ弁獗诩y飾特征受外界條件影響不大，而花粉的形狀和大小受試驗條件的影響較大。本研究中花粉形態(tài)特征對姑婆山野生皺皮柑和姑婆山野生元橘的起源、分類及親緣關(guān)系的鑒定提供了一定的依據(jù)，但需進一步結(jié)合解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)、基因組學(xué)等方面的研究進行更加深入的研究。

圖版Ⅰ 實驗材料花粉形態(tài)掃描電鏡赤道面觀察結(jié)果(×6 000)
1～28 對應(yīng)品種名見表1
Plate Ⅰ SEM observation results of the experimental materials on equatorial view(×6 000)
1-28. The corresponding varieties are shown in Table 1

圖版Ⅱ 實驗材料花粉形態(tài)掃描電鏡極面觀察結(jié)果(×6 000)
1～28對應(yīng)品種名見表1
PlateⅡ SEM observation results of the experimental materials on polar view(×6 000)
1-28. The corresponding varieties are shown in Table 1

圖版Ⅲ 實驗材料花粉形態(tài)掃描電鏡花粉外壁紋飾觀察結(jié)果(×24 000)
1～28對應(yīng)品種名見表1
Plate Ⅲ SEM observation results of the experimental materials on pollen exine ornamentation(×24 000)
1-28. The corresponding varieties are shown in Table 1