徐 皓，周天華，張智強(qiáng)，白 橋

(1 陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001；2 陜南秦巴山區(qū)資源生物綜合開(kāi)發(fā)協(xié)同中心，陜西漢中 723001)

延胡索又名元胡，為罌粟科(Papaveraceae)紫堇屬(Corydalis)植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang)的干燥塊莖，性味辛溫，味苦，歸肝、脾經(jīng)，能行血中氣滯，具有理氣止痛，活血化瘀的功效[1-2]。臨床常用于胸肋、脘腹疼痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻、跌打腫痛等癥[3]。

延胡索主要分布于浙江、江蘇、安徽、陜西等地，以浙江東陽(yáng)、磐安、縉云和永康等地及江蘇南通地區(qū)栽培面積最大。近年來(lái)，陜西漢中的種植面積由2008年4 355 hm2已發(fā)展到2017年的6 700多hm2，面積和產(chǎn)量占到全國(guó)的75%左右，已經(jīng)成為漢中市中藥材產(chǎn)業(yè)的支柱品種之一。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR，simple sequence repeat)是一種以特異性引物PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記方法，也叫微衛(wèi)星DNA，通常以1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)成長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列[4]。1970年左右，人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在真核生物基因組中普遍含有簡(jiǎn)單的重復(fù)序列，且不同物種重復(fù)單位數(shù)和重復(fù)序列存在豐富的差異。重復(fù)序列的兩端一般情況下是趨于保守的單拷貝序列，因此可設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，該方法同時(shí)具備RAPD和RFLP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，而且克服了它們的不足，因而成為目前分子標(biāo)記的熱點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測(cè)及目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選等領(lǐng)域[5]。但迄今尚沒(méi)有利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)延胡索進(jìn)行遺傳多樣性分析的相關(guān)報(bào)道。

本研究首次應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)19個(gè)居群的360份延胡索樣本進(jìn)行了分析，旨在揭示其遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，并據(jù)此了解其進(jìn)化潛力和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，為科學(xué)保護(hù)和利用延胡索植物資源提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)采集了延胡索19個(gè)居群，360份樣本的新鮮葉片，放入自封袋中加硅膠干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室保存在-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，其中漢中城固、漢中南鄭和浙江東和的延胡索材料為栽培種，其余的材料均為野生種，居群采樣基本數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

1.2 方 法

1.2.1延胡索DNA的提取采用改良的CTAB法提取24份樣品中的基因DNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和A260/A280吸光比值，并用濃度為1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性，凝膠成像儀拍照觀(guān)察并記錄結(jié)果。

1.2.2PCR擴(kuò)增利用開(kāi)發(fā)及篩選的12對(duì)引物對(duì)24份供試樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體系為10 μL，DNA 模板1 μL，Mix 5 μL，正反引物各1 μL，ddH2O 2 μL。PCR反應(yīng)程序：首先94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度下45 s，72 ℃延伸 45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.3聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)完成PCR擴(kuò)增后24 h內(nèi)，取2.5 μL PCR產(chǎn)物在10%非變性聚丙烯酰胺凝膠上恒電壓140～160 V電泳10～15 h(依據(jù)目標(biāo)條帶大小而異)；用0.2%NaOH銀染30 min，用去離子水漂洗3次后，用3%AgNO3進(jìn)行銀染；去離子水漂洗后，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.4延胡索遺傳多樣性分析使用Excel 2007和Bio-rad quantity 軟件對(duì)電泳后的凝膠圖像采用人工讀帶方式進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)。應(yīng)用GenALEx 6.3軟件進(jìn)行各居群地理距離和遺傳距離相關(guān)性分析，用以檢測(cè)居群間的相互關(guān)系。使用POPGENE Version 1.32 軟件，分析各引物的等位基因數(shù)(Na)、遺傳雜合度(He)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)、遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)，計(jì)算各引物的遺傳多樣性和近交指數(shù)(Fis)；還采用該軟件計(jì)算了各種群的地理距離和遺傳距離，并做了兩者相關(guān)性檢驗(yàn)(Mantel)，采用MEGA5.0軟件基于各居群的遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析。此外，為分析延胡索的遺傳關(guān)系，應(yīng)用Structrue V2.3.4[6]軟件來(lái)確定所有樣本的聚類(lèi)分組，并構(gòu)建了各樣本的遺傳關(guān)系圖，使用Arlqequin3.0計(jì)算變型間與變型內(nèi)的遺傳變異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與引物擴(kuò)增效果

紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，提取到的延胡索葉片DNA濃度均在100 ng/μL之間，A260/A280吸光比值均在1.8～1.9之間，基本上沒(méi)有蛋白質(zhì)雜質(zhì)污染。瓊脂糖凝膠電泳顯示，提取到的延胡索DNA長(zhǎng)度均大于2 000 bp，能夠用于擴(kuò)增及檢測(cè)。12對(duì)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果顯示，所有樣品均成功擴(kuò)增出條帶(圖1)，具有較高的穩(wěn)定性和多態(tài)性。

2.2 延胡索遺傳多樣性與遺傳分化

表2和表3為12對(duì)SSR引物和19個(gè)居群360份樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，得到的等位基因數(shù)、觀(guān)察雜合度等遺傳多樣性與遺傳分化指數(shù)信息。表3顯示12對(duì)SSR引物中檢測(cè)到4～9個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)目為5.25個(gè)，這些微衛(wèi)星引物的觀(guān)察雜合度為0.178 9～0.465 8，平均值為0.335 5；期望雜合度為0.413 8～0.785 2，平均值為0.635 1。表2顯示觀(guān)測(cè)等位基因數(shù)總和為43.826 1，有效等位基因數(shù)總和33.217 7；Shannon信息指數(shù)范圍為0.520 1～0.775 0，平均值為0.613 2；遺傳多樣性指數(shù)范圍為0.340 2～0.470 0，平均值為0.387 9。一般近交系數(shù)(Fis)值越接近于零，說(shuō)明基因型分布越接近于平衡狀態(tài)，F(xiàn)is值為正說(shuō)明雜合子缺失，F(xiàn)is值為負(fù)說(shuō)明雜合子過(guò)剩。表3顯示，F(xiàn)is數(shù)值有正有負(fù)，最大為0.454 9，最小為-0.245 3，平均為0.135 1，表明延胡索居群整體基因型表現(xiàn)為雜合子缺失；遺傳分化系數(shù)(Fst)值平均為0.388 3，大于0.25，說(shuō)明有38.83%的遺傳變異存在于群體間，絕大部分變異(61.17%)位于群體內(nèi)，群體間有很大的遺傳分化。

表1 延胡索19個(gè)居群采樣基本信息

M.PUC-18 DNA marke； 1～20.漢中城固(CG)居群的20個(gè)個(gè)體圖1 引物 Cyuan15 對(duì)城固(CG)居群的擴(kuò)增效果圖M. PUC-18 DNA marker; 1-20. 20 samples of population CGFig.1 Amplification pattern of population CG using the primer pair Cyuan15

2.3 居群主相關(guān)性分析和聚類(lèi)分析

基于居群遺傳距離進(jìn)行UPGMA法聚類(lèi)分析(圖2)?？梢钥闯鲅雍?9個(gè)居群明顯分為4個(gè)組：采自陜西但引種自江西的兩個(gè)種群(CG和NZ)與華東的3個(gè)居群(JX、JS、BT)聚為一小支，采自漢中但引種自浙江的居群(HZ)與浙江的3個(gè)居群(DT、SW、XW)聚為一小支，然后這兩個(gè)小支組成一支；華北3個(gè)居群(XY、TH、SD)聚為一支；采集自華東的AH、DH、HX和MZ聚為一支；華中與華南3個(gè)居群(HB、HN、GX)聚為一大支。聚類(lèi)分析的結(jié)果表明，當(dāng)ΔK=4時(shí)，K值最大(圖3)，說(shuō)明19個(gè)延胡索居群分為4支較為合理；此時(shí)，19個(gè)居群的聚類(lèi)結(jié)果與UPGMA樹(shù)完全一致。

表2 19個(gè)居群的延胡索遺傳多樣性分析

表3 12對(duì)延胡索引物的遺傳多樣性

AMOVA分析表明(表4)，47.28%的遺傳變異位于居群之間，其中25.94%變異在4個(gè)地理單元之間發(fā)生，52.72%遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi)。Nm(基因流)為0.393 8(<1)，說(shuō)明延胡索居群的基因交流較低。Mantel 檢測(cè)顯示，延胡索居群之間的遺傳距離與其相應(yīng)的地理距離呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r= 0.326，P= 0.01)。

3 討 論

遺傳多樣性分析是研究物種起源進(jìn)化、發(fā)現(xiàn)新的優(yōu)異基因、改良現(xiàn)有育種材料的基礎(chǔ)工作。因此，延胡索的種質(zhì)資源及其遺傳多樣性是延胡索遺傳改良和新品種選育的基礎(chǔ)。對(duì)延胡索遺傳多樣性的評(píng)價(jià)有利于了解其遺傳背景、保護(hù)延胡索種質(zhì)資源，同時(shí)，可以促進(jìn)有利基因發(fā)掘、鑒定延胡索最優(yōu)親本組合。通過(guò)對(duì)19個(gè)居群共計(jì)360個(gè)樣本的延胡索研究，12對(duì)引物的平均觀(guān)測(cè)雜合度(Ho)為0.335 5，平均期望雜合度(He)為0.635 1，遺傳多樣性指數(shù)為(H)為0.387 9，信息指數(shù)(I)為1.192 6，遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.388 3，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。

延胡索的遺傳結(jié)構(gòu)是該物種自交為主的繁育系統(tǒng)、克隆生長(zhǎng)、地理隔離以及居群間有限的基因流共同作用的結(jié)果。

繁育系統(tǒng)可以對(duì)延胡索居群間遺傳分化產(chǎn)生影響。一般來(lái)說(shuō)，自交為主的物種，平均Gst為0.51，即居群間的遺傳變異占總變異的一半以上；而異交為主的物種，Gst為0.10，即90%的遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi)部[7]。本研究中延胡索的Gst為0.388 3，表明延胡索可能是自交為主的繁育系統(tǒng)，這與徐皓[8]等對(duì)延胡索傳粉生物學(xué)的研究結(jié)果是一致的。

居群編號(hào)同表1圖2 基于Nei’s無(wú)偏差遺傳距離的UPGMA 聚類(lèi)樹(shù)Population number is the same as Table 1Fig.2 UPGMA dendrogram based on Nei’s unbiased genetic distance

A.基于ΔK值的最適K值計(jì)算；B. K=4時(shí)Structure 分組結(jié)果，圖中同一顏色表示屬于同一分支圖3 19個(gè)延胡索種群的貝葉斯聚類(lèi)圖A. Inference of best K using the ΔK method；B. Bar plots showing assignment probabilities from structure analysis when K = 4, the same color in the figure represents the same clusterFig.3 Cluster dendrogram 19 populations of C. yanhusuo based on Bayes analysis

表4 延胡索居群的AMOVA分析

注：Fct.由哈溫平衡預(yù)期值而來(lái)的地區(qū)間的遺傳差異程度；Fsc.由哈溫平衡預(yù)期值而來(lái)的地區(qū)內(nèi)居群間的遺傳變異程度；Fst.由哈溫平衡預(yù)期值而來(lái)的地區(qū)間居群間的遺傳變異程度Note:Fct. The degree of genetic difference between regions derived from the expected values of Havin equilibrium;Fsc. The degree of genetic difference among populations in the region derived from the expected values of Havin equilibrium;Fst. The degree of genetic difference between populations in the region derived from the expected values of Havin equilibrium

克隆生長(zhǎng)也是產(chǎn)生顯著遺傳分化的一個(gè)重要因素。通過(guò)野外觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，延胡索可以通過(guò)其塊莖進(jìn)行無(wú)性繁殖。Pluess及 Erickson 等指出[9-10]物種的克隆繁殖會(huì)影響有性繁殖的資源供給，最終會(huì)導(dǎo)致該物種居群內(nèi)及其種群間的遺傳分化。Cook也指出[11]植物的克隆生長(zhǎng)能夠增強(qiáng)該物種對(duì)資源的利用能力，進(jìn)而可提高其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。另外，植物的克隆繁殖還會(huì)導(dǎo)致近交衰退和雜合度的降低，進(jìn)一步影響該植物的適合度，最終導(dǎo)致種群間的遺傳分化[12]。因此，延胡索的克隆生長(zhǎng)也是其具有顯著遺傳分化的因素之一。

地理隔離是植物遺傳分化顯著的重要原因。植物遺傳學(xué)普遍關(guān)注地理環(huán)境和遺傳變異之間的關(guān)系，許多研究表明，地理環(huán)境的分布與遺傳變異具有一定的關(guān)聯(lián)性。Mantle檢測(cè)表明，本研究中居群間的遺傳距離和地理距離存在著顯著相關(guān)性(r= 0.326，P= 0.01)，說(shuō)明地理隔離在延胡索目前居群的遺傳結(jié)構(gòu)中起著重要作用。本研究中主相關(guān)性分析和UPGMA聚類(lèi)保持一致，將19個(gè)居群的延胡索樣本分為4個(gè)組，其中華北聚為一支，華東聚為一支，華中、華南地區(qū)聚為一支，浙江的及引種自浙江的幾個(gè)居群聚為了一支，這也驗(yàn)證了Mantle檢測(cè)的分析結(jié)果，表明地理隔離在遺傳分化中起著作用。

群體的遺傳變異是基因流和選擇作用的綜合結(jié)果。同種植物各個(gè)群體空間上的隔離、突變、環(huán)境因子造成的選擇差、隨機(jī)遺傳漂變、基因流的隔離都能導(dǎo)致群體基因結(jié)構(gòu)的空間異質(zhì)性，從而促進(jìn)群體分化[13]。Slatkin[14]認(rèn)為當(dāng)基因流大于 1 時(shí)，能發(fā)揮其均質(zhì)化作用，維持遺傳變異的多樣性；基因流小于 1 時(shí)，遺傳分化可以由遺傳漂變引起，進(jìn)而對(duì)居群遺傳結(jié)構(gòu)造成影響。通常情況下，基因流受限的植物比基因流廣泛的植物遺傳分化大。本研究延胡索居群間基因流Nm為0.393 8，小于1，表明受限的基因流也是其具有顯著遺傳分化的因素之一。

野生延胡索的繁殖能力強(qiáng)，但適應(yīng)能力弱，加之人為過(guò)度采挖造成野生資源的急劇減少。近幾年在陜西、四川和云南等地陸續(xù)開(kāi)始延胡索的大面積種植，在一定程度上緩解了需求增長(zhǎng)和資源危機(jī)的矛盾。本研究中延胡索的遺傳特征，不僅提供了有關(guān)延胡索遺傳結(jié)構(gòu)的重要見(jiàn)解，而且對(duì)延胡索的養(yǎng)護(hù)管理也至關(guān)重要。實(shí)地考察表明，人類(lèi)活動(dòng)造成了延胡索居群的急劇縮小和居群的碎片化。這種條件可能使延胡索對(duì)遺傳漂變的耐受性很低，可能導(dǎo)致其資源滅絕。因此，維持有效的居群規(guī)模和減少人為干擾，是延胡索保育工作的先決條件?；谘雍髟诰尤核缴线z傳多樣性低，物種水平上的遺傳多樣性豐富，居群間遺傳分化顯著，我們提出以就地保護(hù)為主的保護(hù)策略，并建立多個(gè)保護(hù)點(diǎn)，從而保護(hù)自然居群及其周?chē)纳常瑪U(kuò)大延胡索居群的規(guī)模，讓其進(jìn)行自然更新，從而對(duì)延胡索的遺傳多樣性進(jìn)行保護(hù)。