江 如，周文冠，趙思華，尹 晗，楊文鈺，舒 凱

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130)

ABI4(abscisic acid-insensitive 4)最初是在松屬裸子植物中發(fā)現(xiàn)的一類屬于APETALA2/ethylene responsive factor(AP2/ERF)家族類的轉(zhuǎn)錄因子[1]。Finkelstein利用射線照射篩選到了對(duì)脫落酸(abscisic acid，ABA)不敏感的擬南芥突變體種子，它能夠在ABA存在的條件下正常萌發(fā)，而野生型WT(Col-0)種子無法正常萌發(fā)，因此命名為abi4(abscisicacidinsensitive4)[2]。包括本課題組在內(nèi)的大量前期研究表明，ABI4能結(jié)合與ABA相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)，直接介導(dǎo)其基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)還能間接調(diào)控一系列基因的表達(dá)，包括胚后期發(fā)育、種子萌發(fā)與休眠、幼苗生長(zhǎng)、非生物脅迫響應(yīng)、ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂類代謝、開花調(diào)控和光合作用途徑上的基因[3-10]。

在模式植物擬南芥中，通過生物化學(xué)和遺傳學(xué)的方法，已發(fā)現(xiàn)ABI4的多個(gè)靶標(biāo)基因。在這些基因中，有受其轉(zhuǎn)錄激活的，也有受其轉(zhuǎn)錄抑制的，如ABI4 可以直接結(jié)合ABI5、SBE2.2、DGAT1等基因的啟動(dòng)子，促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄[11-12]；另一方面，ABI4也可直接與AOX1a、Lhcb等基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，進(jìn)而抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄[13-15]。這表明，ABI4 作為轉(zhuǎn)錄因子，可能并非簡(jiǎn)單的以單體行使功能，而很可能是與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，視不同的靶標(biāo)基因，決定行使轉(zhuǎn)錄激活或是抑制的功能[16]。

ABI4在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。在種子的發(fā)育及萌發(fā)方面，ABI4能夠提高三酰甘油的合成基因DGAT1的表達(dá)，提高了三酰甘油含量，并對(duì)其分解有一定的抑制作用[11]，為種子的萌發(fā)儲(chǔ)存足夠的能量，當(dāng)其發(fā)生突變以后，萌發(fā)率降低。同時(shí)，ABI4還通過正調(diào)控ABA合成、負(fù)調(diào)控GA合成，進(jìn)而促進(jìn)種子休眠。ABI4作為ABA和GA之間實(shí)現(xiàn)拮抗生理的重要樞紐，從而精細(xì)調(diào)控種子的休眠水平及萌發(fā)速率[5-6]。ABI4 作為一種含AP2 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在側(cè)根發(fā)育過程中起著重要作用。在ABI4過表達(dá)(OE-ABI4)植株中，負(fù)責(zé)編碼生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍椎腜IN1基因的表達(dá)水平下降，影響了生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，使得側(cè)根的生長(zhǎng)受到了抑制，因此abi4突變體的側(cè)根長(zhǎng)度和密度均高于野生型[17]。abi4還表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫不敏感的表型[18]，有研究表明ABI4 可以結(jié)合HKT1;1啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)而調(diào)控植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)能力[8]。此外，ABI4能夠通過正調(diào)控開花關(guān)鍵基因FLC的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控開花時(shí)間，ABI4是繼ABI5以來在ABA途經(jīng)上新鑒定到的調(diào)控開花的關(guān)鍵基因[9]。這些研究表明，擬南芥ABI4在植物發(fā)育的各個(gè)階段以及非生物脅迫響應(yīng)過程中，具有重要的生物學(xué)功能。

目前，對(duì)ABI4的研究大多數(shù)集中在擬南芥等模式作物中，而在作物尤其是栽培大豆等豆科作物中的研究較少。大豆作為重要的蛋白質(zhì)和油脂的來源，分布范圍廣，種植面積較大，是全球最為重要的糧、油、飼兼用作物之一。長(zhǎng)期以來，各種環(huán)境問題(如土地鹽堿化等)對(duì)大豆生長(zhǎng)造成不良影響，進(jìn)而影響大豆的產(chǎn)量[19]。本研究對(duì)大豆GmABI4進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，檢測(cè)了其時(shí)空表達(dá)特征，這將為進(jìn)一步深入研究大豆GmABI4的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

本研究采用的大豆品種為‘南豆-12’，是中國(guó)西南地區(qū)廣泛栽培的大豆品種。種子在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地種植、收獲以及儲(chǔ)存。選取大小均一，顆粒飽滿，無明顯病蟲害的大豆種子播種于土壤中，放入人工氣候室(溫度25 ℃，相對(duì)濕度60%，12 h光周期)培養(yǎng)。分別在植物生長(zhǎng)過程中進(jìn)行不同組織取樣，大豆幼苗取根和莖、大豆生長(zhǎng)至第一片真葉時(shí)(VE期)取真葉、第一片復(fù)葉時(shí)(V1期)取復(fù)葉、盛花時(shí)(R2期)取花瓣、豆粒鼓到最大時(shí)(R6期)取豆莢。所有樣品經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于提取總RNA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大豆GmABI4基因的鑒定及生物信息分析從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥的ABI4氨基酸序列。在Phytozome網(wǎng)站(http://www.Phytozome.net/)與大豆數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)[20]，得到2個(gè)GmABI4蛋白序列。通過NCBI Blast進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)；利用ExPASy ProtParam Tool 分析GmABI4編碼的蛋白的理化性質(zhì)；ExPASy ProtScale軟件分析其疏水性；用IBCP在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)GmABI4的二級(jí)結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Signalp 4.1在線軟件，并根據(jù)蛋白序列的特征，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法和隱馬氏模型方法進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用TMHMM在線軟件對(duì)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；運(yùn)用MEGA 7軟件，以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[21]。

1.2.2引物設(shè)計(jì)先在TAIR中使用基因編號(hào)獲取相應(yīng)的氨基酸序列，將其導(dǎo)入Phytozome V 12.0(Blast)中以檢索編碼相應(yīng)氨基酸序列的大豆基因序列。將相應(yīng)的大豆基因序列導(dǎo)入Beacon Designer 8與大豆cDNA文庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并進(jìn)行引物合成，并確保引物最適退火溫度在60 ℃左右。引物序列見表1，引物的合成與測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 qPCR相關(guān)的引物序列

1.2.3RNA提取和cDNA第一鏈合成RNA采用酚/氯仿方法進(jìn)行提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整度，Nanodrop plus(Thermo Scientific)測(cè)定其濃度和純度。按照M-MLV(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行cDNA第一鏈合成。

1.2.4基因表達(dá)分析以大豆根、莖、真葉、復(fù)葉、花和豆莢為組織材料，提取總RNA并合成cDNA第一條鏈。qRT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按Vazyme公司的VazymeTMAceQ qPCR SYBR說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系稍作修改，總體系為10 μL：其中AceQ qPCR SYBR Mix 5 μL，引物分別加0.2 μL，cDNA 2 μL，最后用ddH2O補(bǔ)齊至10 μL。在Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR System上進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)材料3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。SPSS進(jìn)行顯著性分析，Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆GmABI4-1和GmABI4-2氨基酸的序列比對(duì)分析

將大豆中GmABI4氨基酸序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示，與雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)XP_012457656.1和陸地棉(Gossypiumhirsutum)XP_016724531.1序列一致性分別為81%和83%，與櫻桃(Prunusavium)XP_021805597.1和榴蓮(Duriozibethinus)XP_022744412.1的氨基酸序列一致性為81%。序列比對(duì)結(jié)果顯示，GmABI4與不同物種氨基酸在58～166 bp處有較高的一致性，說明該區(qū)段在進(jìn)化的過程中高度保守，可能具有重要的生物學(xué)功能(圖2)。

2.2 GmABI4-1和GmABI4-2生物信息學(xué)分析

2.2.1GmABI4-1和GmABI4-2基因及蛋白的理化性質(zhì)分析GmABI4編碼蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，該蛋白分子式分別為C1536H2365N479O492S5和C1603H2456N480O526S6，其中丙氨酸Ala(19，5.9%；19，5.6%)，精氨酸Arg(19，5.9%；18，5.3%)，天冬酰胺Asn(29，9%；32，9.5%)，谷氨酰胺Gln(20，6.2%；15，4.4%)，絲氨酸Ser(40，12.7%；51，15.1%)，纈氨酸Val(31，9.6%；23，6.8%)，甘氨酸Gly(22，6.8%；22，6.5%)等氨基酸含量較高，而半胱氨酸Cys(3，0.9%；2，0.6%)，甲硫氨酸Met(2，0.6%；4，1.2%)等含量較低。該蛋白的預(yù)測(cè)分子量分別為35.58 kD和37.06 kD，理論等電點(diǎn)為8.96和8.46，不穩(wěn)定系數(shù)為47.15和58.09，可能是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白，總的平均親水指數(shù)-0.755和-0.762。ExPASy ProtScale預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白(圖1)。

2.2.2GmABI4-1和GmABI4-2的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在線軟件SOPMA預(yù)測(cè)GmABI4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)，結(jié)果顯示含有大量的延伸鏈(Extended strand)和無規(guī)則卷曲(Random coil)，分別占氨基酸總量的26.01%和50.15%。α螺旋(Alpha helix)和β轉(zhuǎn)角(Beta turn)僅占氨基酸總量的16.1%和7.74%。由此可見該蛋白主要以無規(guī)則卷曲元件為主。利用SWISS-MODEL對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖4)，結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)相吻合。

圖1 GmABI4-1與GmABI4-2蛋白親水性預(yù)測(cè)Fig.1 Hydrophilic regions of protein GmABI4-1 and GmABI4-2

KRH14926.1. 大豆GmABI4-1；XP_014622037.1. 大豆GmABI4-2；XP_014504327.1. 綠豆；XP_020209993.1. 木豆；XP_012457656.1. 雷蒙德氏棉；XP_016724531.1. 陸地棉；XP_021805597.1. 甜櫻桃；XP_022744412.1. 榴蓮圖2 GmABI4與其他物種ABI4氨基酸序列比對(duì)KRH14926.1 Glycine max ABI4-1；XP_014622037.1 Glycine max ABI4-2；XP_014504327.1 Vigna radiata；XP_020209993.1 Cajanus cajan；XP_012457656.1 Gossypium raimondii；XP_016724531.1 Gossypium hirsutum；XP_021805597.1 Prunus avium；XP_022744412.1 Durio zibethinusFig.2 Multiple alignment of GmABI4 with those of other species

圖4 GmABI4-1和GmABI4-2三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The tertiary structure prediction of GmABI4-1 and GmABI4-2

2.2.3GmABI4-1和GmABI4-2的蛋白信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)信號(hào)肽預(yù)測(cè)有助于蛋白結(jié)構(gòu)分析和蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。利用Signalp 4.1在線軟件，并根據(jù)蛋白序列的特征，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法和隱馬氏模型方法進(jìn)行預(yù)測(cè)。是否分泌蛋白用mean S-score判斷，信號(hào)肽切割位點(diǎn)用Y-score maximum 判斷。結(jié)果顯示，GmABI4-1和GmABI4-2的mean S值分別為0.098和0.102，均小于0.5，不存在信號(hào)肽(圖5)。利用TMHMM在線軟件對(duì)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明這2個(gè)蛋白均不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2.4GmABI4-1和GmABI4-2同源性分析在數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇具有功能的不同物種的ABI4蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。結(jié)果(圖6)顯示，來自不同植物的ABI4主要分為三大類，其中大豆中的GmA-BI4-1和GmABI4-2 的同源關(guān)系最近，其次與野生大豆有較高的同源性。

圖5 GmABI4-1 和GmABI4-2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.5 The signal peptide prediction of GmABI4 and GmABI4-2

圖6 GmABI4-1 和GmABI4-2的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of GmABI4-1 and GmABI4-2

圖7 GmABI4-1 和GmABI4-2在大豆不同組織中的表達(dá)量分析Fig.7 Expression of GmABI4-1 and GmABI4-2 in different tissues of soybean

2.3 GmABI4-1和GmABI4-2在不同組織中的表達(dá)分析

以大豆干種子為對(duì)照，以GmTubulin為內(nèi)參，qRT-PCR分別分析了GmABI4-1 和GmABI4-2基因在大豆的不同組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明(圖7)，GmABI4-1和GmABI4-2在大豆不同組織中均有表達(dá)，其中在種子和豆莢中的表達(dá)量較高，而在根、莖、葉中表達(dá)量較低。這2個(gè)基因在大豆種子和種子形成過程中表達(dá)水平較高，表明該基因可能在此過程中發(fā)揮著重要的作用。

3 討 論

大豆是世界上最重要的糧油作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)受環(huán)境的影響較大。提高大豆對(duì)非生物脅迫的耐受能力和其對(duì)光能的利用效率，對(duì)于提高大豆對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力具有重要的意義。ABI4在植物種子萌發(fā)和種子發(fā)育期間發(fā)揮著重要的作用。目前已在多種物種中鑒定和克隆到ABI4家族基因，然而在大豆中的研究尚少，尚無對(duì)大豆中GmABI4家族基因進(jìn)行鑒定和分析的報(bào)道。本研究利用已測(cè)序的大豆(Williams 82)基因組序列[22]，共鑒定到2個(gè)GmABI4基因。眾所周知，染色體加倍是植物進(jìn)化的主要?jiǎng)恿ΓS多植物都經(jīng)歷過染色體加倍事件[23]。大豆作為古四倍體作物，進(jìn)化過程中經(jīng)歷了染色體加倍，使其基因的拷貝數(shù)增加[24]，大豆中GmABI4基因?yàn)?個(gè)，可能與其經(jīng)歷的染色體加倍有關(guān)。

ABI4屬于植物特有的一類AP2家族轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究克隆了大豆中的GmABI4-1和GmABI4-2，并經(jīng)過與其他的物種進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其在N端的結(jié)構(gòu)域具有相對(duì)保守的序列。研究發(fā)現(xiàn)ABI4參與調(diào)控的信號(hào)通路有很多，如ABI4調(diào)控種子休眠與萌發(fā)[5,7,10]、負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的開花[9]、參與質(zhì)體(包括葉綠體和線粒體)與細(xì)胞核之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控[14,25]、通過促進(jìn)甘油三酯合成基因DGAT1的表達(dá)，促進(jìn)甘油三酯的合成，并抑制其降解[11]等。

本實(shí)驗(yàn)qPCR檢測(cè)不同組織特異性表達(dá)結(jié)果表明，GmABI4-1和GmABI4-2均具有明顯的組織表達(dá)特異性，其在種子和豆莢中的表達(dá)量較高，而在根、莖、葉等組織中表達(dá)量都很低，推測(cè)其可能在大豆種子的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。本文已經(jīng)對(duì)GmABI4基因的生物信息學(xué)分析及其表達(dá)特征進(jìn)行探究，將為進(jìn)一步深入研究大豆GmABI4的生物學(xué)功能奠定一定基礎(chǔ)。