王 贊，陳 丹，岳 川，曹紅利，郭雅玲

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，茶學(xué)福建省高校重點實驗室, 福州 350002)

脫落酸(abscisic acid, ABA)作為一種重要的植物激素不僅在促進根系生長[1]、抑制萌發(fā)[2]、花芽分化及成花調(diào)控[3]、促進果實成熟和脫落[4]等重要植物生理活動中起作用，同時在植物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮不可替代的生理效應(yīng)。在高等植物中ABA主要以間接方式合成，包括在質(zhì)體內(nèi)C40的玉米黃質(zhì)催化生成環(huán)氧類胡蘿卜素[5]，緊接著被9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)裂解形成C15脫落醛，最后在細胞質(zhì)中合成ABA[6-7]。環(huán)氧類胡蘿卜素裂解氧化形成ABA重要前體物——脫落醛，該反應(yīng)是此通路中的限速步驟，調(diào)控該反應(yīng)的NCED則是公認的關(guān)鍵限速酶[8]。第一個NCED編碼基因是在玉米中鑒定到[9]，目前已經(jīng)在擬南芥中鑒定出5條NCED家族基因[10]，NCED表達水平與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[11]和ABA含量有著直接關(guān)系[12]。

大量研究顯示，逆境脅迫能夠誘導(dǎo)NCED表達進而調(diào)控內(nèi)源ABA的合成，提高植物的抗性。例如將小麥NCED基因在擬南芥中過表達可以提高其對干旱脅迫的耐受性[13]，而抑制該基因表達則導(dǎo)致上游類胡蘿卜素積累，內(nèi)源ABA含量降低，代謝通路阻塞[14]。5條NCED基因之一的NCED2在多種植物中被證明具有重要的抗逆作用。NCED2在葉片和根中的高表達而累積ABA，使得酸橘在田間缺水時具有良好的耐旱性[15]。NCED2上調(diào)表達誘導(dǎo)了黃瓜幼苗抗氧化酶活性，減少應(yīng)激性氧化對光系統(tǒng)的損傷，增加脅迫耐受性[16]。

另外，轉(zhuǎn)錄因子MYB可直接與NCED2啟動子位點結(jié)合調(diào)控ABA生物合成，影響種子新陳代謝促進休眠[17]。另一種轉(zhuǎn)錄因子NAC則誘導(dǎo)擬南芥NCED2過表達而導(dǎo)致葉片衰老[18]。

在茶樹研究中，劉聲傳[19-20]克隆了CsNCED1、CsNCED4基因，分析其在茶樹干旱和復(fù)水下的表達模式。Cho等[21]在研究‘東方美人’烏龍茶做青過程中發(fā)現(xiàn)NCED表達存在顯著性差異，但NCED表達及內(nèi)源ABA含量變化與茶葉香氣品質(zhì)的相關(guān)性還不明確。目前在不同脅迫條件下和其他茶類加工過程中，茶樹CsNCED2基因表達模式分析報道比較少見。所以進一步探明茶樹CsNCED2在多種脅迫的廣譜表達模式，以及在不同加工過程中的脅迫應(yīng)激表達分析有重要意義。

本研究以鐵觀音茶樹品種嫩梢第二葉為供試材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆了一條茶樹CsNCED2全長序列。采用qRT-PCR技術(shù)檢測該基因在茶樹不同組織、閩南烏龍茶做青、白茶萎凋過程以及逆境脅迫中的表達模式，以期為明確CsNCED2參與茶樹抗逆生理活動和加工應(yīng)激響應(yīng)方面提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

2017年4月中旬至10月中旬，于福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)茶學(xué)專業(yè)教學(xué)茶場采制以下試驗材料：

(1)以鐵觀音品種中小開面二、三葉嫩梢的第二葉為供試材料，用于CsNCED2全長克隆驗證。

(2)采摘鐵觀音品種中小開面嫩梢的第二葉、根、莖、花和成熟果，用于研究NCED2在不同組織部位表達模式。

(3)以無性系2年生鐵觀音盆栽幼苗為材料，進行非生物脅迫處理[22-23]。干旱處理：小心取出整棵茶樹，用自來水洗凈根上泥土并防止根系受損，沒入純凈水中約15 min，將茶樹移入配制好的質(zhì)量濃度為100 g·L-1PEG溶液中，分別在處理后的0、4、12 h取樣；低溫處理：使用人工氣候箱進行4 ℃低溫脅迫，取0、1、3、6、12、24、48、72 h處理樣；外源ABA處理：用100 μmol·L-1ABA溶液噴灑茶樹，進行ABA脅迫，取0、6、12、24、48、72 h處理樣。

(4)以鐵觀音品種中小開面二、三葉嫩梢為原料，按照閩南烏龍茶加工工藝付制[24]，在此過程中取鮮葉、曬青葉、一搖后、二搖后、三搖后和殺青前各工序的烏龍茶在制品第二葉。

(5)以福鼎大白茶一芽二葉嫩梢為原料，放置室內(nèi)按白茶萎凋工藝付制。室溫控制在22～25 ℃，相對濕度在70%～75%。取萎凋0、0.25、1、4、8、12、24、48 h白茶萎凋葉在制品。

上述各樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，用錫箔紙包好立即投入液氮冷凍完全，再放置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1總RNA提取和cDNA合成各供試材料用液氮研磨后取0.1～0.2 g，按照天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit(Polysaccharides & Polyphenolice-rich，離心柱型)說明書方法提取茶樹總RNA。RAN完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，濃度和純度使用NanoDrop2000超微量分光光度計測定。達到實驗要求的總RNA移入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

按照TaKaRa的PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA，用于后續(xù)的RT-PCR和qRT-PCR。

1.2.2CsNCED2基因全長cDNA克隆根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19]分析得到CsNCED2基因序列，Blastx比對結(jié)果顯示具有完整開放閱讀框。在該序列上下游的起始、終止密碼子附近設(shè)計全長引物CsNCED2-f-F和CsNCED2-f-R進行RT-PCR擴增(表1)。50 μL RT-PCR擴增體系為：模板1 μL，TransStart KD Plus DNA 聚合酶1 μL，5×TransStart KD Plus 緩沖液10 μL，dNTPs 4 μL，引物1 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，68 ℃反應(yīng)2 min，68 ℃延伸10 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后割膠回收純化，立即連接到pEASY-Blunt Zera Cloning載體，質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細胞，挑選3個陽性克隆菌液送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3CsNCED2基因生物信息學(xué)分析基因全長序列在NCBI網(wǎng)站進行ORF查找和同源性分析；序列經(jīng)過ClustalW比對后利用MEGA7.0 軟件采用鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹；使用DNAMAN軟件進行多序列聯(lián)配比對；利用在線分析工具http://expasy.org/tools中的ProtParam、TargetP、SingalP4.1 Server、ChloroP軟件對編碼氨基酸序列進行理化性質(zhì)、亞細胞定位和信號肽的生物信息學(xué)分析；利用NetPhos 3.1 Server、TMHMM server2.0、FoldIndex軟件進行磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)、可折疊特性分析；使用GOR4、SWISS-MODEL軟件模擬蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)并用Pymol軟件進行編輯。

1.2.4CsNCED2基因表達模式分析根據(jù)CsNCED2全長cDNA序列設(shè)計熒光定量PCR特異性引物qCsNCED2-F和qCsNCED2-R(表1)。采用TransStart?Tip Green qRT-PCR superMix試劑盒，按照說明書進行實驗操作，在Bio-Rad CFX96 Touch熒光定量PCR儀上檢測CsNCED2基因表達，分析鐵觀音不同組織部位、白茶萎凋和烏龍茶做青過程，以及低溫、干旱和外源ABA非生物脅迫條件下的相對表達模式。實驗結(jié)果利用Excel 2016按照2-ΔΔCt方法進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsNCED2基因克隆及序列分析

從茶樹轉(zhuǎn)錄組獲得的CsNCED2序列進行比對，結(jié)果顯示有完整的ORF。在ORF兩端設(shè)計引物擴增其全長獲得大約1 900 bp目的條帶(圖1)，測序拼接后得到完整cDNA。Blastn結(jié)果表明，與葡萄VvNCED2 (AAR11194.1)相似性最高，達到78%，因此命名為CsNCED2(NCBI登錄號為MF765770)。該序列全長1 931 bp，包含42 bp 5′非編碼區(qū)(5′-UTR)，1 821 bp ORF以及68 bp 3′非編碼區(qū)(3′-UTR)，共編碼606個氨基酸殘基。

M.DL2000；1.CsNCED2基因PCR產(chǎn)物圖1 CsNCED2基因全長擴增M.DL2000；1.PCR products of CsNCED2Fig.1 The full length amplification of CsNCED2

表1 引物序列

陰影為葉綠體轉(zhuǎn)運肽；方框為起始密碼子和終止密碼子；下劃線為NCED基因保守結(jié)構(gòu)域FLNO2258圖2 CsNCED2基因核酸序列及其編碼氨基酸序列A putative chloroplast-targeting transit peptide is in shadow. The start and stop codons are framed. NCED gene specific hits FLNO2258 is underlinedFig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of CsNCED2 cDNA

2.2 CsNCED2蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

對CsNCED2蛋白序列進行理化性質(zhì)預(yù)測分析，結(jié)果表明，蛋白分子量為67 665.88 Da，共編碼606個氨基酸。理論等電點為6.27，半衰期30 h，總平均親水性為-0.332，不穩(wěn)定系數(shù)為44.43，表明該蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白。

NetPhos 3.1 Server磷酸化位點分析推測CsNCED2多肽鏈上共有61個磷酸化位點。TMHMM server2.0預(yù)測顯示不存在跨膜結(jié)構(gòu)。TargetP結(jié)果表明位于葉綠體。SingalP4.1 Server預(yù)測CsNCED2蛋白序列不存在信號肽序列，屬于非分泌性蛋白。ChloroP預(yù)測顯示(圖2)CsNCED2蛋白含有葉綠體轉(zhuǎn)運肽，為第1～50個氨基酸殘基。已有研究結(jié)果顯示，NCED在葉綠體中催化紫黃質(zhì)或新黃質(zhì)等環(huán)氧類胡蘿卜素形成黃質(zhì)醛這一重要的ABA前體物質(zhì)[10]，進一步推測CsNCED2蛋白屬于NCED家族。

4個活性保守位點用紅色表示，黃色表示具有親水脂性的α螺旋區(qū)，藍色為NCED蛋白特征保守結(jié)構(gòu)域序列MIAHPKxDP，綠色為NCED蛋白特征保守結(jié)構(gòu)域序列HDFAITE圖3 CsNCED2蛋白三維結(jié)構(gòu)Four conserved histidine residues required for activity with color of red. The putative amphipathic a-helix domain with color of yellow. The conserved domain of NCED protein MIAHPKxDP with color of blue. The conserved domain of NCED protein HDFAITE with color of greenFig.3 Three-dimensional structure analysis of CsNCED2 protein

FoldIndex軟件可折疊特性預(yù)測結(jié)果顯示有序氨基酸殘基數(shù)量占序列總比例的77.22%，判斷CsNCED2是一個有序蛋白。CsNCED2蛋白二級結(jié)構(gòu)包括24.75%的α螺旋，57.76%的無規(guī)則卷曲和17.49%延伸鏈。CsNCED2蛋白三級結(jié)構(gòu)與玉米VP14蛋白(3npe.1.A)相似性高達70.25%，并基于此建模。GMQE分值為0.76，說明該模型建立的可信度較高。通過Pymol軟件編輯輸出3D結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.3 CsNCED2蛋白序列聯(lián)配及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

進行Blast同源及保守結(jié)構(gòu)域分析比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsNCED2屬于9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶家族,具有植物NCED家族保守結(jié)構(gòu)域FLNO2258。CsNCED2與多個物種的NCED有較高的相似性，均在70%以上。其中與葡萄VvNCED2 (AAR11194.1)、可可TcNCED5(EOY27680.1)和柑橘CrNCED5 (ASK51187.1)相似性分別達到78%、77%和77%。

方框表示NCED家族特有保守結(jié)構(gòu)域序列MIAHPKxDP和HDFAITE；*表示4個活性保守位點；1.茶樹CsNCED2；2.葡萄VvNCED2；3.柑橘CrNCED5；4.可可TcNCED5；5.甜橙CsNCED2；6.柚子CmNCED2；7.砂梨PpNCED3圖4 CsNCED2氨基酸序列與其他植物的多重序列比對The conserved domain of NCED protein MIAHPKxDP and HDFAITE are framed; * expression four conserved histidine residues required; 1.Camellia sinensis；2.Vitis vinifera；3.Citrus reticulata；4.Theobroma cacao；5.Citrus sinensis；6.Citrus maxima；7.Pyrus pyrifolia Fig.4 Multiple alignment of amino acid sequences of CsNCED2 and homologous genes in other plants

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相似度較高的已經(jīng)報道的NCED蛋白序列，利用DNAMAN軟件進行聯(lián)配比對，結(jié)果顯示(圖4)，90～606氨基酸殘基與其他物種序列高度匹配。它們都具有親水脂性的α螺旋區(qū)、NCED家族特有保守結(jié)構(gòu)域序列MIAHPKxDP和HDFAITE以及4個活性保守位點，與之前報道的結(jié)果一致[28-29]。茶樹CsNCED2與其他13種植物的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果(圖5)表明，CsNCED2與葡萄VvNCED2聚為一類，說明二者的親緣關(guān)系最近。

2.4 CsNCED2熒光定量表達模式分析

2.4.1不同組織部位表達模式分析CsNCED2在鐵觀音茶樹不同組織部位相對表達量顯示(圖6，A)，該基因在根、莖、葉、花、果中均有表達，但是表達模式差異較大。在花中的表達量最高，而在根和果中表達量較低。

2.4.2在白茶和烏龍茶加工過程中表達模式分析檢測CsNCED2在白茶、烏龍茶加工過程中的表達模式，結(jié)果顯示，在白茶萎凋過程中(圖6，B)，從0～12 h表達量緩慢增加，在萎凋24 h時顯著上調(diào)并且達到峰值，之后下降但表達水平依然顯著高于0 h時的表達水平。在烏龍茶做青過程中(圖6，C)，從鮮葉至?xí)袂嘟Y(jié)束，CsNCED2表達量顯著增加了3倍，達到第一個峰值。在之后的搖青階段下降至本底水平，直到殺青前被誘導(dǎo)而顯著增加了3倍達到第二個峰值。

圖5 CsNCED2蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of CsNCED2 protein

不同小寫字母表示顯著差異水平(P<0.05)圖6 CsNCED2表達分析The different normal letters indicate significant difference at 0.05 levelsFig.6 Expression analysis of CsNCED2

2.4.3非生物脅迫下表達模式分析100 μmol·L-1外源ABA處理下(圖6，D)，CsNCED2在6 h的表達量較0 h顯著上調(diào)了6倍，處理24 h后，其表達量顯著下調(diào)。

4 ℃低溫處理下(圖6，E)，0～12 h內(nèi)快速上調(diào)，在1 h就達到顯著水平,12 h時表達量最高。隨著處理時間的延長，24和72 h時的表達水平顯著降低。

從對干旱脅迫響應(yīng)的表達模式可看出(圖6，F(xiàn))，在100 g·L-1PEG處理過程中，隨著干旱脅迫的加劇，CsNCED2的表達量持續(xù)顯著下調(diào)。

3 討 論

ABA參與到植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)的重要調(diào)節(jié)過程中[30-31]，NCED作為關(guān)鍵限速酶直接調(diào)控內(nèi)源ABA含量[32]。本研究克隆得到一個茶樹CsNCED2基因，具有NCED家族保守結(jié)構(gòu)域FLNO2258以及MIAHPKxDP和HDFAITE特征序列，與前人研究結(jié)果一致[33]。已有研究表明NCED氨基酸中的組氨酸殘基可以結(jié)合Fe2+使NCED蛋白發(fā)揮功能[34]，并且存在葉綠體轉(zhuǎn)運肽結(jié)構(gòu)[35]。CsNCED2蛋白氨基酸存在4個組氨酸活性位點，另外亞細胞定位于葉綠體并具有N-端葉綠體靶向信號肽序列，這進一步證明CsNCED2具有在質(zhì)體中裂解環(huán)氧類胡蘿卜素生成ABA前體的生物活性。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示與葡萄VvNCED2親緣關(guān)系最近，氨基酸序列相似性達到78%。

CsNCED2在不同組織部位的表達存在顯著差異。CsNCED2在莖、葉和花中的表達量顯著高于根和成熟的果實，而在花中的表達又顯著高于莖和葉。Tian等[35]通過半定量PCR(semiquantitative RT-PCR)檢測枸杞LcNCED基因在根、莖、葉花中也存在相同的模式，隨著果實成熟表達量逐漸下降，在成熟期的果實中表達量同樣很低。Wang等[36]在黃瓜轉(zhuǎn)錄本中的研究表明NCED可能參與果實的成熟調(diào)控。

茶樹葉片在加工過程中遭受到許多脅迫的影響，例如干旱、高溫、光照和翻動等，而這些也正是茶葉品質(zhì)形成的關(guān)鍵[37-38]。本試驗結(jié)果顯示，在白茶萎凋前期CsNCED2表達量增加緩慢，萎凋后期表達量維持在高水平。烏龍茶加工過程中CsNCED2在曬青和殺青前的室內(nèi)攤放過程中上調(diào)表達。Cho等[21]發(fā)現(xiàn)NCED表達量和ABA含量都在烏龍茶曬青階段迅速增加，并指出ABA合成基因不僅受到加工脅迫的誘導(dǎo)，而且內(nèi)源ABA的增加將提高茶葉中揮發(fā)性化合物的含量。Baldermann等[39]同樣認為茶葉對各種脅迫的防御反應(yīng)可能導(dǎo)致加工過程中的香氣形成。曹潘榮等[40-41]研究表明干旱、低溫脅迫可以不同程度地增加茶樹芳香物質(zhì)組分。本試驗中，經(jīng)過了短時間日光曬青(30 min)后CsNCED2表達量同樣顯著提高。在非脅迫條件下光照不能增加內(nèi)源ABA含量和NCED表達，反之在干旱或者低濕度脅迫下則均能提高[42-44]。因此推測茶葉加工所造成的脅迫誘導(dǎo)了CsNCED2上調(diào)表達，參與了ABA調(diào)控和脅迫響應(yīng)，但與茶葉品質(zhì)的關(guān)系還未明確。

植物將外界環(huán)境的脅迫壓力轉(zhuǎn)換為ABA這種化學(xué)信號，從而能夠適應(yīng)逆境狀態(tài)[30]。例如Sussmilch等[45]發(fā)現(xiàn)膨壓是調(diào)控AtNCED3表達的重要信號，增大細胞膨壓后擬南芥AtNCED3可以快速響應(yīng)，內(nèi)源ABA也在幾分鐘內(nèi)迅速積累。本研究發(fā)現(xiàn)CsNCED2對不同非生物脅迫的響應(yīng)機制不同，在外源ABA和4 ℃低溫處理下，CsNCED2表達量迅速提高，分別在6 h和12 h之后迅速降低。在PEG處理下，CsNCED2表達量隨著脅迫時間延長而持續(xù)下降。Iida等[46]的研究表明穿葉眼子菜PpNCED3在各種逆境脅迫下表達水平不同，受低溫和外源ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達，而在PEG處理2 h后表達量即受抑制而下調(diào)。據(jù)報道，干旱脅迫使得茶樹CsNCED1和CsNCED4轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[19]，NCED可以通過調(diào)節(jié)氣孔運動和增加抗氧化酶活性提高茶樹[20]和柱花草[47]抗逆性?？偟膩碚f，CsNCED2對低溫和ABA處理前期更加敏感，但表達受到干旱脅迫抑制。CsNCED2在茶樹抵御非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，介導(dǎo)了以ABA含量為基礎(chǔ)的氣孔開閉和脅迫氧化應(yīng)激反應(yīng)。

目前，茶樹NCED家族基因還未完全清楚，已公布的也較局限于cDNA序列，基因組序列和啟動子等非編碼序列的報道還很少，具有調(diào)控作用的順式作用元件和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子值得深入挖掘。ABA介導(dǎo)的氣孔調(diào)控不僅涉及茶樹非生物脅迫，而在抵御病原菌等生物脅迫中也有重要作用，因此可以進一步開展生物脅迫下NCED的響應(yīng)模式分析。由脅迫帶來的茶樹品質(zhì)改變，特別是與ABA含量和關(guān)鍵代謝基因NCED的關(guān)系還值得后續(xù)深入研究。本研究克隆了鐵觀音CsNCED2基因，進一步確定了CsNCED2在低溫、外源ABA介導(dǎo)的脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，為后續(xù)在模式植物中實現(xiàn)異源表達和茶樹ABA下游信號傳導(dǎo)途徑的研究提供理論依據(jù)。