張 慧，于家強，那 威，徐梓純

（農業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，黑龍江省普通高等學校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

在現代肉雞養(yǎng)殖業(yè)中，快大型肉雞生長速度得到了明顯的提高，然而，在肉雞快速生長的同時，腹脂蓄積過多和腹水綜合征等也隨之產生，給肉雞生產者帶來了重大的經濟損失[1-3]。其中脂腹脂沉積過多，不僅會降低肉仔雞的飼料轉化效率，減少分割肉產量，同時也會降低肉仔雞的商品價格；另外過多的腹脂沉積在加工時會造成環(huán)境污染，并且影響禽類的產蛋率、受精率以及孵化率等[4-5]。因此，降低肉雞腹脂沉積，控制脂肪在畜禽體內的過度沉積已成為是家禽遺傳育種工作者亟需解決的問題。

本課題組柳曉峰等[6]以東北農業(yè)大學F2資源群體為研究材料，利用微衛(wèi)星標記構建了雞1號染色體連鎖圖譜，并對雞1號染色體上控制體脂和體重性狀的QTL進行了初步定位；并在此基礎上又通過提高標記密度和擴大群體規(guī)模的方法對這些QTL進行了精細定位，結果將影響雞體脂和體重性狀的QTL分別定位于1號染色體3.7 Mb和5.5 Mb的區(qū)域內，并通過生物信息學分析鑒定出RB1基因等與雞體脂性狀相關的重要基因[7]。同時本課題組利用Realtime RT PCR的方法檢測了RB1基因在東北農業(yè)大學高、低脂雙向選擇品系第十六世代1～7周齡雞只腹部脂肪組織中的表達情況，結果發(fā)現RB1基因在高脂系中的表達量均低于高脂系，且在6、7周齡差異顯著。綜合以上結果，推測RB1基因可能與雞脂肪組織生長發(fā)育的有關。

因此，本研究結合課題組前期的研究結果，以東北農業(yè)大學高、低脂雙向選擇品系第十一世代雞只為試驗材料，對雞60K SNP芯片上位于RB1基因上的4個SNP位點進行多態(tài)性分析，進而分析與腹脂性狀的相關性，確定RB1基因上影響雞腹脂性狀的重要突變位點，從而為深入研究RB1基因影響雞脂肪組織生長發(fā)育的遺傳機理提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 高、低脂雙向選擇品系第十一世代雞只共計475只雄性個體（低脂系203只，高脂系272只）。雞群按常規(guī)商品肉雞飼養(yǎng)程序統(tǒng)一進行飼養(yǎng)管理，7周齡時稱量活重后屠宰，測定腹脂重，同時計算腹脂率（腹脂率=腹脂重/7周齡活重）。7周齡時翅靜脈采血，苯酚-氯仿法提取基因組DNA后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 基因型分析將高、低脂系十一世代的475只

2.1 等位基因頻率在高、低脂系間的差異比較RB1基因上4個SNP位點等位基因頻率在高、低脂系間的差異，結果發(fā)現Gga_rs13552715、GGalu-GA054680和GGaluGA054691位點的等位基因頻率在高、低脂系間存在顯著差異（P＜0.05），而GGalu-GA054667位點的等位基因頻率在高、低脂系間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 SN P多態(tài)性與腹脂性狀的相關分析利用JMP 7.0軟件進行SNP多態(tài)性與雞腹脂重和腹脂率的相關分析，結果見表2。由表2可以看到，GGalu-GA054691位點多態(tài)性對腹脂重有顯著影響（P＜0.05），Gga_rs13552715和GGaluGA054667位點多態(tài)性與腹脂重有一定程度的相關（P＜0.2）；GGalu-個體基因組DNA與雞60K SNP芯片進行進行雜交，獲得基因型數據。獲得基因型數據后進行基因型質量控制，將雜交質量不好的位點去掉，最終在雞RB1基因上有4個SNP位點的基因型可以用于后續(xù)統(tǒng)計分析。

1.2.2 統(tǒng)計分析根據試驗材料的群體特點，利用JMP 7.0軟件進行基因型與性狀的關聯分析，構建基因型效應分析的統(tǒng)計模型如下：

其中，Y為性狀觀測值，μ為群體均值，G為基因型固定效應，L為品系固定效應，F（L）為品系內家系的隨機效應，D（F，L）為家系與品系內母雞的隨機效應，e為隨機效應。使用統(tǒng)計軟件JMP 7.0檢驗基因型與性狀間的相關程度，并估計性狀的最小二乘均值。建議顯著水平為P＜0.2，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

利用Haploview 4.1進行位點間的連鎖不平衡分析。

2 結果與分析

表1 雞RB1基因上4個SNP位點等位基因頻率在高、低脂系間的差異Table 1The differences of allele frequency of 4 SNP loci in chickenRB1gene between the lean and fat lines

表2 雞RB1基因上4個SNP多態(tài)性與腹脂重和腹脂率的相關分析結果（P值）Table 2association analysis between four SNPs of chickenRB1gene and abdominal fat weight and abdominal fat percentage

GA054691和Gga_rs13552715位點多態(tài)性對腹脂率有顯著影響（P＜0.05），GGaluGA054667位點多態(tài)性與腹脂率有一定程度的相關（P＜0.2）；而GGalu-GA054680位點多態(tài)性與腹脂重和腹脂率的相關程度都沒有達到顯著水平（P＞0.2）。

2.3 連鎖不平衡分析對雞RB1基因上與腹脂性狀有一定程度相關或顯著相關的3個SNP位點進行連鎖不平衡程度分析，結果發(fā)現Gga_rs13552715和GGaluGA054691位點處于強的連鎖不平衡狀態(tài)（r2=0.55＞0.3）（圖1）。說明這兩個位點可能連鎖在一起發(fā)揮作用，對肉雞腹脂沉積有重要的影響。

3 討論

圖1 雞RB1基因上與腹脂性狀相關的3個SNP位點的連鎖不平衡情況Fig.1Linkage disequilibrium of three SNPs associated with abdominal fat traits in chickenRB1gene

RB1基因作為一個抑癌基因，因其在視網膜母細胞瘤中缺失而被發(fā)現[8]，與視網膜母細胞瘤密切有關，所以又叫視網膜母細胞瘤基因。RB1基因編碼PRb蛋白，調控多個細胞進程[9]，包括細胞凋亡，細胞增殖，骨骼肌細胞、成骨細胞及脂肪細胞的分化等[10-12]。

3.1 PRb與細胞增殖PRb是染色質蛋白，其主要通過調控E2F轉錄因子來限制細胞周期相關基因的轉錄，達到對細胞周期負調控的目的[13]。在細胞周期的G1期到S期的過渡階段，PRb被磷酸化，釋放E2F，隨后E2F激活細胞周期相關靶基因的轉錄，使細胞周期順利進行。

3.2 PRb與細胞分化RB1基因可以對通過對特定基因的轉錄激活來調節(jié)細胞分化[14]。在人的內臟和皮下脂肪組織中，RB1（mRNA、蛋白和活性）與BMI（體重指數）和胰島素抵抗呈負相關，但是與促進脂肪形成的基因的表達（PPARγ、IRS1）呈正相關。BMI增加主要是由于脂肪含量下降。RB1基因在人脂肪細胞分化過程中，蛋白質的表達量和活性都顯著地增加。在完全分化的人脂肪細胞中，干擾RB1降低了脂肪細胞的成脂性[15]。Chen等[16]通過對小鼠的胚胎成纖維細胞的研究發(fā)現，體外培養(yǎng)條件下，有活性的PRb存在時，胚胎成纖維細胞可以分化成脂肪細胞；當PRb缺失時，胚胎成纖維細胞不能分化成脂肪細胞，而當使用野生型PRb轉染缺失PRb的細胞時，小鼠胚胎成纖維細胞又能夠分化成脂肪細胞。通過進一步的研究發(fā)現，產生上述現象的原因是小鼠成纖維細胞中PRb能激活C/EBPs家族介導的轉錄途徑，從而誘導脂肪細胞分化過程。Classon等[17]在3T3成纖維細胞的研究中也發(fā)現隨著PRb濃度的增加，C/EBPα介導的轉錄途徑被激活，細胞進行分化，缺失PRb的3T3成纖維細胞分化受到嚴重阻礙。Cole等[18]在研究3T3-L1前脂肪細胞系時發(fā)現非磷酸化的PRb能夠抑制C/EBPβ與DNA的結合活性，過表達PRb能夠抑制C/EBPβ對C/EBPα的轉錄激活作用，進而抑制脂肪細胞分化。以上結果顯示，RB1對脂肪細胞分化的調節(jié)在不同的細胞中可能具有不同的作用。鼠上，PRb不但對白色脂肪細胞的分化有很重要的作用，同時也是棕色脂肪細胞分化的負調控者[19-20]。實際上，鼠上的很多研究結果都顯示，PRb的失活導致白色脂肪組織棕色化[21-23]。

3.3 PRb與肥胖高脂飲食會對下丘腦ARC（弓狀核）造成損傷。ARC神經元在調節(jié)食物吸收及能量消耗方面發(fā)揮重要作用。下丘腦中的ARC包含2種神經元，POMC和AGRP/NPY，分別負調控和正調控能量平衡過程。研究中發(fā)現，在高脂飲食誘導的肥胖小鼠中，高脂飲食抑制PRb，從而解除PRb對E2F靶基因的抑制作用。在POMC神經元中，缺失RB1，導致細胞再進入細胞周期，細胞凋亡等過程的發(fā)生；但是在AGRP/NPY神經元，缺失RB1并沒有影響。RB1在減少食欲的POMC神經元和增加食欲的AGRP/NPY神經元中的不同作用，為形成肥胖提供直接的依據[24]。

本研究中試驗群體為東北農業(yè)大學高、低脂雙向選擇品系，這兩個品系有共同的祖先，是通過對腹脂率和血漿中VLDL濃度的進行雙向選擇選育出來的。隨著選擇世代的增加，腹脂性狀差異明顯，理論上和腹脂性狀有關的等位基因頻率在高、低脂系間也會逐漸分離。本文中，比較RB1基因4個SNP位點等位基因頻率在高、低脂系間的差異，結果發(fā)現，3個SNP位點的等位基因頻率在高、低脂系間存在顯著差異。

對RB1基因上4個SNP位點的多態(tài)性分析發(fā)現，其中的3個SNP位點多態(tài)性與腹脂重和腹脂率存在顯著或一定程度的相關，進一步連鎖不平衡分析發(fā)現兩個位點處于強連鎖不平衡狀態(tài)，說明這兩個位點可能連鎖在一起，對肉雞腹脂沉積有顯著影響。綜合群體遺傳學分析結果以及相關分析結果，本研究通過試驗證實，RB1基因確實是影響雞腹脂沉積的重要基因。本研究結果為后續(xù)該基因影響雞腹脂沉積的機制研究奠定了一定的基礎。