何念鵬,劉　遠,徐　麗,溫學發(fā),于貴瑞,孫曉敏

1 中國科學院地理科學與資源研究所生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡觀測與模擬重點實驗室,北京　100101 2 中國科學院大學資源與環(huán)境學院, 北京　100049

1　土壤有機質(zhì)分解及其對溫度變化的響應

土壤有機質(zhì)是陸地生態(tài)系統(tǒng)最大的碳庫,儲存了約1500 Pg有機碳(1 Pg=1015g)[1]。土壤有機質(zhì)分解所釋放的CO2是陸地生態(tài)系統(tǒng)與大氣間最大的氣體交換通量之一(60 Pg C a-1),約為化石燃料燃燒的10倍[2]。大量研究表明：土壤有機質(zhì)分解速率(R或土壤呼吸速率)與環(huán)境溫度關系非常密切；在未超過土壤微生物活性最適溫度的情況下,R與溫度整體呈正相關關系,并可用直線方程、指數(shù)方程或冪函數(shù)方程等來描述[3]。土壤有機質(zhì)分解速率及其對溫度的響應,長期以來一直是生態(tài)學和土壤學研究的核心問題之一。在全球變暖背景下,土壤有機質(zhì)分解對溫度變化的響應很大程度影響著陸地生態(tài)系統(tǒng)對全球氣候變化反饋效應,成為近二十年研究的熱點[4-5]。目前,世界各地的科學家,采用室內(nèi)培養(yǎng)、野外控制實驗、模型模擬等多種途徑,揭示土壤有機質(zhì)分解對溫度變化的響應。受篇幅的限制,本文主要聚焦在土壤有機質(zhì)分解的室內(nèi)培養(yǎng)方法與測定模式。

2　土壤有機質(zhì)分解溫度敏感性的定義、理論基礎與主要計算方法

2.1　土壤溫度敏感性定義及其重要性

土壤有機質(zhì)分解速率(R)對溫度變化的響應非常敏感。長期以來,科學家廣泛地采用指數(shù)方程描述溫度對有機質(zhì)分解的影響,并形成了簡單的經(jīng)驗模型,這些模型都主要是從Hoff和Lehfeldt[6]提出的化學反應的溫度指數(shù)模型中派生而來。在具體操作上,科研人員采用溫度敏感性參數(shù)(Temperature sensitivity,Q10)來刻畫土壤有機質(zhì)分解對溫度變化的響應程度[3,7-8]。通常,Q10是指溫度每升高10 ℃狀況下,R所增加的倍數(shù)；Q10值越大,表明土壤有機質(zhì)分解對溫度變化就越敏感。Q10不僅取決于有機質(zhì)分子的固有動力學屬性,也受到環(huán)境條件的限制。

Q10能抽象地描述土壤有機質(zhì)分解對溫度變化的響應,在不同生態(tài)類型系統(tǒng)、不同研究間架起了一個規(guī)范的和可比較的參數(shù)。因此,Q10一經(jīng)提出就廣受關注,并成為過去幾十年土壤學和生態(tài)學研究的核心內(nèi)容之一?？茖W家圍繞Q10時空變異和影響機制等開展了大量研究工作[3-4],Q10也成為了絕大多數(shù)機理模型的重要參數(shù)。然而,由于不同傳統(tǒng)培養(yǎng)模式與測試方法的可比性較弱,科學家在短期內(nèi)難以給機理模型(尤其是大尺度模型)提供一套兼顧時空變異特征的Q10參數(shù),許多模型仍是依據(jù)土壤酶動力學特征推導而將Q10設定為2.0或1.5[9-10]。根據(jù)IPCC第五次評估報告,過去130年全球氣溫升高約0.85 ℃,并且全球氣溫升高的趨勢仍會繼續(xù)[5]。因此,氣候變暖如何影響土壤有機質(zhì)分解,以及陸地生態(tài)系統(tǒng)如何響應氣候變暖就倍受關注。鑒于科學家已經(jīng)對Q10影響因素、控制機制和區(qū)域變異等進行了多方面的綜述[3-4],本文重點探討室內(nèi)培養(yǎng)與測試方法對Q10的影響。

2.2　Q10時空變異與影響機制研究中的重要理論基礎

為了更好地理解培養(yǎng)模式和測試方法的影響,首先回顧一下在Q10時空變異與影響機制研究的理論基礎；其中,兩個非常重要的理論基礎是Arrhenius方程和Michaelis-Menten方程。

(1)Arrhenius方程

早期,人們采用從經(jīng)典化學反應中衍生出來的指數(shù)方程來描述土壤有機質(zhì)分解與溫度變化之間的關系,但后來Arrhenius指出即使放熱的化學反應,也需要一點“推力”來促使反應發(fā)生,這個“推力”叫做“活化能”。因此,Arrhenius[11]于1889年根據(jù)動力學原理發(fā)展了Arrhenius方程:

(1)

式中,k是反應速率常數(shù),A是擬合參數(shù),Ea是反應所需要的活化能(J-1mol-1),R是氣體常數(shù)(8.314 K-1mol-1),T是開氏溫度[3]。

Arrhenius方程的內(nèi)涵: 具有復雜分子特性的有機質(zhì)(如：難分解有機質(zhì)、復雜有機質(zhì),以及礦物吸附有機質(zhì))具有較低的分解速率,分解過程需要更高的活化能,因此具有更大的Q10值。換句話說：隨著溫度增加,具有足夠能量參與反應的分子增加相對減少,導致溫度敏感性降低[3]。此外,Arrhenius方程表明溫度敏感性隨著有機質(zhì)穩(wěn)定性的增加而增加,因為穩(wěn)定的底物需要更高的活化能而變得不活躍。這也意味著穩(wěn)定的碳庫比易分解的碳庫對溫度變化更加敏感。

Arrhenius方程的局限性：雖然Arrhenius方程在許多研究中都被應用或證明,但是只有在底物有效性不受限制的條件下最為適用,此時獲得的溫度敏感性被稱為土壤的固有溫度敏感性[3]。然而,土壤有機質(zhì)分解還經(jīng)常受到土壤水分和底物有效性等因素的影響,當土壤底物有效性較低或底物嚴重受限制的條件下,Arrhenius方程不再適用,此時的溫度敏感性被稱為表觀溫度敏感性[3]；隨著研究的深入,科研人員提出米氏方程(Michaelis-Menten equation)來補充解釋該現(xiàn)象。

(2)Michaelis-Menten方程

RS=Vmax×[S]/(Km+[S])

(2)

式中,[S]是底物有效性,也是在酶活性位點處的底物濃度；Vmax是給定溫度下的最大反應速率；Km是米氏常數(shù)[11],代表酶與底物的親和能力,用最大速率一半(Vmax/2)時的底物濃度表示,也是反映溫度敏感性的重要參數(shù)[12-13]。

米氏方程的理論基礎：Km和Vmax均是對溫度變化敏感的參數(shù),當?shù)孜餄舛萚S]充足,并且溫度沒有超過酶活性的最適溫度時,Km對反應的影響不重要,這時Vmax對溫度的響應決定了反應速率的溫度敏感性。這一過程只取決于基于Arrhenius方程的酶催化作用。Vmax隨著溫度升高逐漸升高。然而,當?shù)孜镉行暂^低時(當S與Km大致相當或遠低于Km),Km成為一個重要影響因子,這時分解速率取決于酶和底物的濃度。由于Km和Vmax均隨著溫度升高而增加,因此Km和Vmax的溫度敏感性會相互抵消[3]。這種“抵消作用”在底物濃度很低的時候尤為明顯。Michaelis-Menten方程可以更好地解釋外來物質(zhì)輸入或底物消耗情景下的Q10變化。

2.3　Q10主要計算方法

Q10計算方法主要有以下幾種：

(1)指數(shù)方程推算法

經(jīng)驗模型認為土壤有機質(zhì)分解速率隨溫度增加呈指數(shù)上升。

RS=A×ebT

(3)

Q10=e10b

(4)

式中,RS是土壤有機質(zhì)分解速率,A是指數(shù)方程擬合參數(shù),b是溫度敏感性系數(shù),T是培養(yǎng)溫度。

(2)直接定義法

根據(jù)Q10定義,在相同的培養(yǎng)時間計算不同培養(yǎng)溫度下土壤有機質(zhì)分解速率的比值。

(5)

式中,T1和T2是培養(yǎng)溫度,R1和R2分別是溫度T1和T2下土壤有機質(zhì)的分解速率。

(3)等碳庫法

在長期培養(yǎng)條件下,高溫會促進土壤快速分解,底物消耗較大；因此,在相同培養(yǎng)時間下,不同培養(yǎng)溫度下的底物質(zhì)量存在較大差異。為了克服等時間方法造成的底物消耗問題,Conant等[14]提出利用不同培養(yǎng)溫度下分解相同比例的碳所用時間的比值來表示Q10。

(6)

式中,T1和T2是培養(yǎng)溫度,t1和t2分別是在溫度T1和T2下分解相同土壤有機碳所需要的時間。該方法有兩個重要的前提假設：1)在不同培養(yǎng)溫度下,參與反應的微生物類群理論上是相同的；2)在不同培養(yǎng)溫度下,參與分解的有機質(zhì)組分的化學特性在時間序列上都是從易分解到難分解。

(4)模型方法

利用一階動力學的單庫或多庫模型擬合土壤有機質(zhì)分解累積曲線,得到擬合的溫度敏感性參數(shù)k,然后根據(jù)公式7計算Q10[15]。

(7)

式中,Ccum是累積分解釋放的CO2量,C0是土壤初始有機碳含量,t是培養(yǎng)時間,Q10和k是模型擬合的參數(shù),T1和T2是培養(yǎng)溫度。

3　Q10研究的傳統(tǒng)室內(nèi)培養(yǎng)與測試模式及其優(yōu)缺點

科研人員以土壤有機質(zhì)分解對溫度變化的響應特征、Q10計算方法和基本理論為基礎,設計并發(fā)展了一系列經(jīng)典的室內(nèi)培養(yǎng)與測試模式,并被廣泛應用。

3.1　恒溫培養(yǎng)+間斷測定模式(模式A)

圖1　土壤有機質(zhì)溫度敏感性研究的3種主要培養(yǎng)與測試模式Fig.1　Three models of incubation and measurement modes for the studies of the temperature sensitivity of soil organic matter (SOM) decomposition

室內(nèi)培養(yǎng)實驗中,傳統(tǒng)的Q10研究大多采用了恒溫培養(yǎng)+間斷測試模式[4,14](圖1A)。例如,Conant等采用這種模式測定了不同土地利用方式下土壤有機質(zhì)的溫度敏感性的變化,結果發(fā)現(xiàn)溫度敏感性與土壤有機質(zhì)質(zhì)量密切相關[4]。通常,根據(jù)不同實驗目的或?qū)嶒炇覘l件,研究人員先設置3—6個恒定溫度對土壤進行培養(yǎng)(如5、10、15、20、25、30 ℃等),然后在天、周、月間隔,測定RS；在測試方法上,大多采用堿液吸收法或氣相色譜法進行測定,然后再利用所測定的RS和對應溫度計算Q10。該模式最大優(yōu)點是操作簡單、對儀器要求不高,幾乎所有實驗室均具備該模式所需條件。

然而,從理論和實踐角度來看,模式A存在明顯缺陷,一定程度上會影響實驗結論的準確性和可靠性。具體概括如下：1)在恒定溫度下培養(yǎng),土壤微生物可能會對特定溫度產(chǎn)生適應性,從而對實驗結果產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn),在不同恒定溫度培養(yǎng)下,土壤微生物的結構和功能具有明顯的分化和差異[16]。2)恒定培養(yǎng)溫度會導致不同處理樣品間的底物消耗不一致,尤其是高溫vs.低溫和短期vs.長期,可通過改變底物有效性而對實驗結果產(chǎn)生明顯影響。例如,將土壤樣品分別在5、15、25 ℃培養(yǎng)一段時間,25℃培養(yǎng)會導致土壤樣品中易分解組分的快速消耗,甚至引起活性底物供應不足；由于長期高溫培養(yǎng)時會導致土壤底物消耗很大,從而低估Q10。3)由于模式A方法本身的限制,使得大多數(shù)研究只能采用較少的溫度系列(3—5個),導致用于計算Q10的不同溫度的數(shù)據(jù)偏少。由于計算過程中大多是采用曲線擬合,較少的溫度處理水平會影響Q10擬合精度。4)模式A測試過程比較費時費力,難以同時或?qū)Υ笈鷺悠愤M行測試。

3.2　漸近式變溫培養(yǎng)+間斷測定模式(模式B)

為了彌補模式A的不足,特別是克服模式A從方法及機理上難以準確估算Q10的問題,近年來科研人員發(fā)展了漸進式變溫培養(yǎng)+間斷測定模式[8](圖1B)。例如,Fang等采用這種漸近式變溫培養(yǎng)模式研究了不同有機質(zhì)組分溫度敏感性的差異,發(fā)現(xiàn)易分解有機質(zhì)和難分解有機質(zhì)對溫度變化具有相同的敏感性[8]。另外,Ding等也采用該方式研究了不同高寒草地生態(tài)系統(tǒng)土壤有機質(zhì)分解溫度敏感性的區(qū)域變異及其控制機制[17]。簡單而言,該模式對同一批土壤樣品采用逐漸升溫,然后再降溫的培養(yǎng)方式,同時配套低頻度的間斷測定模式測定土壤有機質(zhì)分解速率。首先,將土壤樣品在適宜的溫度下培養(yǎng)3—7 d,實現(xiàn)土壤樣品活化并防止脈沖式效應對實驗結果的干擾。隨后,采用氣象色譜或者CO2紅外氣體分析儀的方法測定土壤樣品的分解速率,在完成特定溫度的測試任務后,將培養(yǎng)溫度升高到預先設定的溫度,并在土壤樣品適應和穩(wěn)定一段時間后,測定該溫度狀況下的土壤有機質(zhì)分解速率；依序升溫直到預定的最高溫度,隨后再采用逆向降溫模式進行隨后的培養(yǎng)與測試[17-19]。

該模式較好地克服了模式A的前兩個缺陷,即土壤微生物對恒定培養(yǎng)溫度的適應性以及不同培養(yǎng)溫度底物消耗不均的缺點,是對傳統(tǒng)方法學的重要改進。然而,在實際操作過程中,模式B仍然存在一些問題：1)該方法更適用于短期的培養(yǎng)實驗,難以開展長期測試。例如,對同一批樣品,我們很難準確確定底物消耗成為限制性條件時的培養(yǎng)時間,我們只能憑借經(jīng)驗假設短期內(nèi)(如1—7d)不會出現(xiàn)底物供應受限；因此,模式B難以適用于底物貧瘠或長期培養(yǎng)樣品。2)在測定方法上,模式B依然采用傳統(tǒng)氣相色譜法(CO2紅外分析法)的手動測試模式；同時,由于這種變溫過程較為繁瑣,導致一般溫度處理系列約為4—6個,難以克服因數(shù)據(jù)量不足而引起的Q10誤差。3)變溫培養(yǎng)及測試過程較為繁瑣、費時費力,難以同時對大量樣品進行測試。

4　Q10研究的新一代培養(yǎng)與測試模式(模式C)

毋庸置疑,近年來有關Q10研究的蓬勃發(fā)展,模式A和模式B起到了非常大的推動作用。如第3節(jié)中的討論,它們在理論和操作上仍然存在缺陷,有待進一步改進。因此,改進和發(fā)展新Q10的培養(yǎng)和測試模式,不僅有助于推動Q10研究朝著精準化方向發(fā)展,還有助于拓展和深化Q10的機理研究。

在Cheng和Virginia[20]和He等[21]研究的基礎上,我們發(fā)展了連續(xù)變溫培養(yǎng)結合連續(xù)-高頻土壤微生物呼吸速率的測定裝置與技術,催生了Q10研究的連續(xù)變溫培養(yǎng)+連續(xù)自動測試的新模式(圖1, 模式C)[22-25]。模式C充分利用連續(xù)變溫培養(yǎng)+連續(xù)-高頻土壤微生物呼吸測定裝置聯(lián)用的優(yōu)勢,實現(xiàn)了對土壤樣品連續(xù)變溫培養(yǎng),基本克服了恒溫培養(yǎng)模式(模式A)土壤微生物對特定培養(yǎng)溫度的適應性和底物消耗不均的重要缺陷。模式C通過開發(fā)連續(xù)-高頻土壤微生物呼吸測定系統(tǒng),可結合培養(yǎng)過程的溫度特征,在升/降溫過程中對每個樣品進行連續(xù)的、高頻度的測試(2—20min/次),通過測定更多溫度下土壤微生物呼吸速率來提高Q10的擬合精度。同時,模式的培養(yǎng)與測試過程非常簡單快捷,有利于開展大量樣品測試或大尺度聯(lián)網(wǎng)研究。然而,模式C對實驗設備投入要求較高,亟需開發(fā)成套的商業(yè)設備來推動其廣泛的應用。目前,基于He等[21]原型機的基礎上,已經(jīng)開發(fā)了商業(yè)化的定型產(chǎn)品并公開銷售(Pri- 8800, 原生態(tài)有限公司, 北京),為大面積推廣模式C提供了設備和技術保障。通過上述分析,不論是從基本理論還是操作角度,模式C均優(yōu)于模式A和B,具有非常廣泛的應用前景。

5　連續(xù)變溫培養(yǎng)+連續(xù)自動測試模式的應用前景展望

連續(xù)變溫培養(yǎng)+連續(xù)自動測試模式(模式C)基本克服了傳統(tǒng)的Q10研究的主要缺陷(注：它仍然無法解決室內(nèi)培養(yǎng)與野外狀況的差異,但該問題不屬于本文討論范疇),并具有連續(xù)變溫培養(yǎng)+連續(xù)自動測試的特點,具備自動、連續(xù)、快速的特點。首先,模式C能為大多數(shù)實驗室提供一種快速測試土壤微生物呼吸速率的通用途徑和設備,可替代傳統(tǒng)的堿液吸收法和氣相色譜法[26- 27]。

此外,模式C也能在如下方面開展一系列創(chuàng)新性研究：1)利用其自動、連續(xù)、快速的特點,開展區(qū)域尺度的聯(lián)網(wǎng)研究,揭示不同區(qū)域或植被類型的Q10變異及其控制機制[25]。受傳統(tǒng)培養(yǎng)和測試方法的影響,研究人員很難開展類似的研究,雖然整合分析能一定程度解決這個問題,但也存在不同實驗處理條件和實驗測定方法造成的高不確定性問題。2)開展Q10對連續(xù)溫度變化過程響應研究,更真實的模擬溫度變化情況,從而揭示土壤微生物呼吸對溫度變化的響應機制[24]。受傳統(tǒng)方法的限制,當前大多數(shù)研究均在小時、天、周尺度來開展,并沒有揭示真實的溫度日動態(tài)。3)更好地開展土壤微生物對水分或資源快速變化情景下的研究[23]。例如,降水脈沖是干旱-半干旱區(qū)的常見現(xiàn)象,土壤微生物活性(碳礦化速率或氮礦化速率)對水分可獲得性的響應一直是非常重要又極具挑戰(zhàn)性的科學問題；類似的,土壤微生物對外界資源脈沖式供應的響應或激發(fā)效應也是近期研究熱點。隨著模式C的廣泛使用與進一步改進,尤其是與13C分析設備相結合,相信會具有更多的應用前景。

6　結論

本文結合Q10定義、基本理論和計算方法,探討了當前有關Q10研究培養(yǎng)和測定模式的優(yōu)缺點；尤其是結合最近新發(fā)展的連續(xù)變溫培養(yǎng)+連續(xù)自動測試模式,前瞻性地提出了一系列應用前景。此外,本文希望能呼吁更多國內(nèi)年輕科研人員對基本方法、設備改進的重視,更好更快地推動原創(chuàng)性研究。