高　靜,Said Muhanmmad,岳琳艷,何永濤,斯確多吉,張憲州,孔維棟,*

1 中國科學院青藏高原研究所,高寒生態(tài)學與生物多樣性重點實驗室,北京　100101 2 中國科學院大學資源與環(huán)境學院, 北京　100049 3 中國科學院地理與資源科學研究所,生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡觀測與模擬重點實驗室,北京　100101

卡爾文循環(huán)是自然界中最主要的生物固碳途徑[1]。核酮糖- 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RubisCO)是卡爾文循環(huán)的限速酶和關鍵酶[2]。目前自然界存在4種類型RubisCO (I,II,III,IV),其中RubisCOⅠ是廣泛存在于光合和化能自養(yǎng)生物體中[3]。RubisCOⅠ又可細分為四類,分別是Form IA,IB,IC,ID。RubisCO酶大亞基由cbbL基因編碼,95%以上的固碳生物含有該基因[4]。cbbL基因可作為固碳微生物標記物,已在海洋[5]、湖泊[6]和土壤[7]固碳微生物群落結構和生物多樣性研究中廣泛應用。海洋和湖泊中固碳微生物群落及其固碳能力已經(jīng)得到很多研究,但在土壤固碳微生物群落特征研究很少[7]。

青藏高原因海拔高、年均溫低、干旱和強紫外等等惡劣環(huán)境,導致植物生長受到極大限制,是典型生態(tài)脆弱區(qū)[8]和氣候變化敏感區(qū)[9]。高寒草甸是青藏高原典型地帶性植被生態(tài)系統(tǒng)[10],該生態(tài)系統(tǒng)土壤中碳儲量巨大[11]。近年來高寒草甸土壤微生物研究主要集中在土壤微生物量、土壤微生物活性[12]、土壤微生物群落結構變化[13]和土壤微生物多樣性[14]等方面,但土壤固碳微生物特征及其對高寒草甸土壤碳儲量的貢獻尚未得到深入研究。與低海拔地區(qū)相比,青藏高原植被生長受到極大限制,因此,開展土壤微生物固碳研究對我們理解青藏高原土壤固碳微生物功能及土壤碳循環(huán)過程具有重要意義。

海拔梯度變化綜合了多種環(huán)境因子的梯度效應[15]。隨著海拔梯度的上升,土壤和氣候等環(huán)境因子均發(fā)生改變,從而引起土壤微生物群落多樣性的變化[16]。因此,海拔梯度變化是研究土壤固碳微生物群落特征及其驅動因子的理想自然實驗室。本文采用分子生物學方法(分別為定量PCR、T-RFLP、克隆文庫和測序等方法),研究了青藏高原不同海拔草甸土壤固碳微生物群落結構和多樣性變化規(guī)律,旨在探討不同海拔梯度土壤固碳微生物群落特征及其環(huán)境影響因子。該研究可為深入理解高寒草甸土壤固碳微生物群落特征及土壤碳循環(huán)過程提供理論依據(jù)。

1　研究區(qū)域與方法

1.1　研究地區(qū)概況

本研究區(qū)域位于拉薩市北部當雄縣轄區(qū),距離拉薩市區(qū)約170km,坐標為91°05′E, 30°51′N,平均海拔約4300—4700m,背靠念青唐古拉山脈[17]。該地區(qū)屬于高原性季風氣候,水熱同期,夏季短暫多雨；冬季寒冷干燥,晝夜溫差大。年均溫1.5℃(1960—2000)[18],年降水量476.8mm,其中約80%的降水都集中在3月份至8月份,降水季節(jié)性十分明顯[19]。土壤類型為高寒草甸土,生態(tài)系統(tǒng)為典型高山草甸,植被主要包括建群種矮嵩草,夾雜委陵菜、墊狀點地梅等,隨海拔升高植被類型變化不大,僅地上部生物量增加[20]。

1.2　樣品采集與處理

在念青唐古拉山南坡采樣,在2014年4個季節(jié)采樣,時間分別為2014年3月26日、6月21日、8月26日和10月23日,樣點分布在4400、4650、4800m和5200m的4個海拔,每個海拔在取樣點周圍9m2內(nèi)取3個重復,每個重復土壤由直徑2.5cm的土鉆取3鉆混合而成,取樣深度為0—10cm。土樣采集后裝塑封袋,過2.0mm孔徑篩子后一部分用無菌袋封裝并迅速冷凍,用于微生物群落實驗,于-80℃冷凍保存；另一部分風干后用于土壤理化因子測定。

1.3　土壤理化因子測定

1.4　土壤DNA提取

所有DNA樣品均采用Powersoil? DNA Isolation Kit(MOBIO,USA)試劑盒提取,土壤稱取冷凍土樣0.25g。操作流程按照試劑盒說明書進行。DNA 提取完畢后取2μL DNA溶液檢測DNA濃度和純度(Nanodrop?ND- 1000,USA),并用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.5　基因豐度測定

采用定量PCR(簡稱qPCR)方法檢測樣品中和固碳微生物cbbL基因豐度,PCR擴增引物均為特異性引物,其序列見表1?；蜇S度檢測使用羅氏定量PCR儀(Roche LightCycler480 II,Roche, USA)進行,標線采用含目的片段的已知數(shù)量質粒10倍系列稀釋液[6]。qPCR擴增酶使用SYBR green kit(TaKaRa,大連),反應體系為10μL,包括3μL緩沖液,5μL的酶,引物各0.5μL,1μL DNA模板。qPCR 反應條件為預變性95/94℃ 2 min,94℃變性30 s, 退火溫度分別是：Form IA/B基因61℃,Form IC基因63℃,Form ID基因53℃ 35個循環(huán)。在72℃收集熒光信號。

表1　本研究采用的引物

1.6　固碳微生物群落結構分析

草甸土壤中Form IC類固碳微生物豐度最高,代表主要土壤固碳微生物類群,遠高于Form IAB和ID類固碳微生物。因此,本研究采用末端限制性片段長度多態(tài)性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,簡稱T-RFLP)技術深入分析了Form IC類固碳微生物群落結構和多樣性。利用5′端標記有熒光的引物對功能基因進行擴增,而后用Axygen 公司生產(chǎn)的膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)后進行切膠純化,將純化產(chǎn)物進行限制性酶切,本研究中采用MspI酶切Form IC目的基因片段,酶切產(chǎn)物片段大小和相對量采用ABI 3730xl DNA測序儀(Applied Biosystems,CA,USA)測定,不同末端限制片段(T-RFs)相對量用來計算固碳微生物群落結構和多樣性指數(shù)。

1.7　固碳微生物克隆文庫、測序與DNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

我們對4800m海拔處3月和6月土樣各建立了Form IC類固碳微生物克隆文庫,并測序和進行系統(tǒng)發(fā)育分析。IC固碳基因PCR擴增采用與qPCR相同的引物,PCR反應體系與T-RFLP相同。將每個克隆文庫的PCR樣品按照的膠回收試劑盒說明書進行目的片段的回收純化,純化產(chǎn)物用Promage公司生產(chǎn)的PEGM-T(Promega, USA)連接載體試劑盒進行連接反應并轉化到感受態(tài)細胞中,感受態(tài)細胞采用康為世紀公司生產(chǎn)的DH- 5α菌株；通過LB平板藍白斑篩選隨機挑取白斑(40—45個)；對隨機挑選的白斑進行陽性克隆鑒定和測序,鑒定結果為陽性、片段長度符合目標片段要求的克隆子進行Sanger測序(ABI 3730xl DNA測序儀,Applied Biosystems,CA,USA)；采用MEGA 6.0對獲得的目的基因DNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.8　數(shù)據(jù)分析

克隆文庫測序所得結果使用Mothur v.1.33.3選取相似性大于97%的DNA序列進行OTU劃分,使用鄰接法(neighbor-joining)在MEGA 6.0軟件中構建系統(tǒng)發(fā)育樹。群落結構分析主要利用Canoco 5軟件進行,群落多樣性利用R 3.1.3中的“vegan”軟件包進行計算。相關性和差異顯著性分析采用SPSS. 23軟件,作圖采用Sigmaplot 10.0和Excel軟件。

2　結果與分析

2.1　cbbL基因豐度隨海拔和季節(jié)變化

土壤中各月份Form IAB基因豐度在106拷貝數(shù)/g到108拷貝數(shù)/g之間(圖1)。隨海拔升高,Form IAB的基因豐度逐漸增加,且由4400m至4800m Form增加幅度較大,4800m以上基本持平或稍下降。3月份Form IAB的基因豐度隨海拔變化幅度最小。對海拔和季節(jié)進行雙因素分析可知,季節(jié)及其與海拔的交互作用對Form IAB基因豐度無顯著影響(P>0.631)。

Form IC基因豐度各月份在108拷貝數(shù)/g到109拷貝數(shù)/g之間(圖2)。隨海拔升高,各月份Form IC基因豐度顯著增加,自4400m至4800m增加幅度較快,4800m以上基本持平或有所下降。與其他月份相比,3月份Form IC基因豐度隨海拔升高變化最小。對海拔和季節(jié)進行雙因素分析可知,海拔升高和季節(jié)均顯著影響Form IC基因豐度(P<0.05),且二者交互作用也顯著影響Form IC基因豐度(P<0.01)。

圖1　Form IAB基因豐度隨海拔的變化圖Fig.1　Changes in the abundance of Form IA/B with altitude

圖2　Form IC基因豐度隨海拔的變化圖Fig.2　Changes in the abundance of Form IC with altitude

Form ID基因豐度各月份在105拷貝數(shù)/g到106拷貝數(shù)/g之間(圖3)。隨海拔升高,各月份Form ID基因豐度無明顯變化,且10月份Form ID基因豐度隨海拔升高變化最小。

圖3　Form ID基因豐度隨海拔的變化圖Fig.3　Changes in the abundance of Form ID with altitude

綜上所述,隨海拔升高不同類型固碳微生物豐度變化趨勢不同,Form IC和Form IAB基因豐度隨海拔升高而逐漸增加,Form ID隨海拔變化趨勢不明顯。其中Form IC類固碳微生物豐度在各個海拔均遠高于其他兩類固碳微生物。對比不同季節(jié)間基因豐度的變化情況,在生長季(6月和8月)cbbL基因豐度變化較大,而冬季(3月)變化幅度較小。

2.2　cbbL基因多樣性指數(shù)隨海拔和季節(jié)變化

隨海拔升高各月份Form ICcbbL基因香農(nóng)多樣性指數(shù)均顯著升高, 4800m出達到最高,之后稍下降(圖4)。與香農(nóng)多樣性指數(shù)變化趨勢相似,隨海拔顯著升高各月份Form IC基因群落豐富度顯著升高,在4800m達到最大,之后有所下降(圖5)。與其他月份相比,3月份香農(nóng)多樣性指數(shù)和豐富度變化均最小,可能是由于3月份土壤還在凍融期,土壤溫度與土壤水含量相對較低,故對海拔變化不敏感。

表2　cbbL基因豐度與環(huán)境因子的相關性

*和**分別表示顯著性達到0.05和0.01水平,單尾檢驗

圖4　Form IC基因香農(nóng)多樣性指數(shù)隨海拔的變化Fig.4　Changes in the Shannon diversity of Form IC with altitude

圖5　Form IC基因群落豐富度隨海拔的變化Fig.5　Changes in the richness of Form IC with altitude

2.3　草甸土壤固碳微生物群落結構隨海拔和季節(jié)變化

圖6　Form IC基因群落結構RDA分析圖Fig.6　Redundancy analysis of T-RFLP of Form IC genes 　E：海拔,altitude；SWC：土壤含水量,soil water content；TOC：總有機碳,total organic carbon；T_5：5cm土壤溫度,5cm soil temperature；Season：季節(jié),銨態(tài)氮,ammonium 硝態(tài)氮,nitrate nitrogen

Form IC類土壤固碳微生物群落結構隨海拔升高而發(fā)生明顯變化,但隨季節(jié)變化不明顯(圖6)。根據(jù)海拔變化,固碳微生物群落結構主要分為兩個類群,海拔4400m和4650m聚合為一類,4800m和5200m聚合一類。RDA1和RDA2兩個分量可解釋30.36%群落結構變異,RDA1可單獨解釋變異的23.65%,說明海拔升高導致的土壤水分、有機質含量、pH和土壤溫度等土壤理化因子是驅動固碳微生物群落結構變化的主要因子。RDA2僅解釋固碳微生物群落結構變異的6.71%,其中季節(jié)是驅動RDA2的主要因子,說明群落結構在一定程度存在明顯季節(jié)差異。

2.4　固碳微生物群落組成及其系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究對4800m海拔處3月和6月土壤進行克隆文庫構建和cbbL基因片段序列分析,共得到52個OTUs。本研究土壤中Form IC類固碳微生物屬于3個門(圖7),分別是放線菌(Actinobacteria)、α變形菌(α-proteobacteria)和β變形菌(β-proteobacteria)。放線菌主要Pseudomocardia和Nocardia等微生物,與之前發(fā)現(xiàn)的一些青藏高原草地土壤克隆序列比較相似。α變形菌主要包括一些典型根瘤菌,如Bradyrhizobium,Mesorhizobium和Rhizobium等,β變形菌主要包括一些化能自養(yǎng)型微生物,如Rubrivivax和Variovorvax等固碳微生物。

圖7　Form IC基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7　Neighbor-joining phylogenetic tree of representative form IC cbbL gene sequences

α變形菌占總克隆文庫的比例最高(48.1%),放線菌占38.4%,β變形菌比例最低為13.5%。對比不同月份3種類群所占比例,3月份α變形菌與放線菌所占比例相當分別占45%；6月份α變形菌比例從45%升高至52%,而放線菌比例從45%降低至30%,說明主要包括根瘤菌的α變形菌在生長季比例稍高于非生長季,固碳微生物群落組成隨季節(jié)變化。

3　討論與結論

海拔及其導致的土壤理化因子變化和季節(jié)均影響固碳微生物結構多樣性。土壤pH值、海拔和水分是驅動群落結構變化的關鍵環(huán)境因子,季節(jié)在一定程度上也會影響固碳微生物群落結構,但其影響程度稍弱于土壤理化因子。不同海拔和季節(jié)均使土壤理化和養(yǎng)分發(fā)生改變,從而影響固碳微生物生長和代謝活動,最終導致固碳微生物種群結構的變化。肖可青等研究發(fā)現(xiàn)在稻田土壤中,土壤有機碳和pH值對固碳微生物群落結構具有顯著影響[29]。本文研究表明,隨海拔升高草甸土壤固碳微生物多樣性和豐富度逐漸升高,在4800m達到最高,說明海拔梯度會影響固碳微生物豐度和多樣性變化,這與我們之前的研究結果一致[26]。宋賢沖等人[16]認為土壤含水量可能是造成不同海拔土壤微生物群落功能多樣性差異的主要原因。土壤克隆文庫和測序結果表明,在生長季(3月)和非生長季(6月)草甸土壤Form IC類固碳微生物主要包括3個菌門,分別是放線菌、α和β變形菌。其中α變形菌為優(yōu)勢菌門,主要包括根瘤菌,這與我們之前的研究發(fā)現(xiàn)相似[26]。劉瓊等人[30]也發(fā)現(xiàn)稻田土壤中固碳微生物主要為變形菌和放線菌。有研究表明,β變形菌可以耐受各種環(huán)境壓力,尤其對于酸性土壤中低pH值具有良好的耐受性[31]。

綜上所述,在本研究海拔梯度內(nèi),草甸土壤固碳微生物豐度和群落結構主要受海拔變化影響,而受季節(jié)變化影響較小,其中,隨海拔梯度變化的土壤溫度、土壤含水量、pH值和有機碳是重要的影響因子。固碳微生物多樣性主要受土壤pH值和土壤含水量影響。該研究揭示了高寒草甸土壤固碳微生物豐度、群落結構特征及其環(huán)境驅動因子,為深入理解高寒草地土壤微生物功能和土壤碳循環(huán)過程及其動態(tài)變化提供理論依據(jù)。