陳幫丹，魏 洪，黃亞勵，馮 麗，李俞亭，王芳勝

(1.貴州醫(yī)科大學微生物學教研室/貴州省醫(yī)科大學感染與免疫學實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州省六盤水市人民醫(yī)院檢驗科，貴州六盤水 553000)

我國植物資源豐富，從植物中分離和提取具活性物質(zhì)的內(nèi)生菌可應(yīng)用于新型活性物質(zhì)的生產(chǎn)，制造環(huán)保、高效的新藥。Ezra等從植物中分離得到具有抑菌活性的內(nèi)生菌株對細菌、真菌有明顯的抑制作用[1]，這為天然抗菌物質(zhì)的研究提供了可靠、實用的理論依據(jù)[2]。植物內(nèi)生菌是生活在植物活性組織內(nèi)較為特殊的微生物，包括潛伏在宿主體內(nèi)的病原微生物，是植物組織內(nèi)的正常菌群，也是植物微生物生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成部分[3]。有研究表明，內(nèi)生細菌通常不會傷害植物的各種組織器官，而能夠促進植物的生長[4-5]。天然抗菌物質(zhì)具有抑菌性強、無毒、性能穩(wěn)定、廣譜高效等優(yōu)點，已成為食品及醫(yī)藥研究的熱點[6]。目前，從多種植物中已分離到內(nèi)生菌株。程小梅等從獼猴桃枝、莖、葉及腐爛果實中可分離得到內(nèi)生菌真菌和導致腐爛的細菌[7-8]；王美琴等從番茄內(nèi)分離得到642株內(nèi)生菌株，并應(yīng)用平板法篩選出2株具有抑菌活性的菌株[9]；范曉靜等從銀杏內(nèi)獲得1株具有抑菌活性的解淀粉芽孢桿菌，并采用對峙法明確其抑菌活性[10]；梁盛年等從柑橘枝葉樣本中分離得到內(nèi)生細菌55株，經(jīng)顯微鏡形態(tài)觀察初步鑒定這些菌株分屬5個屬，并采用紙片擴散法(K-B法)確定有12株具有抑菌活性[11]；王夢穎等使用平板傾注法從香蕉中獲得具廣譜活性的菌株[12]；Chen等應(yīng)用形態(tài)學、分子生物學從蘭科植物的種子和根中分離鑒定得到植物內(nèi)生菌[13]；Ziyake等從駱駝刺中分離到20株內(nèi)生菌，并采用瓊脂擴散法篩選具抑菌活性的菌株[14]；Kumar等從姜黃中分離到對大腸埃希菌有抑菌作用的內(nèi)生菌[15]。

獼猴桃為獼猴桃科獼猴桃屬多年生落葉植物，果實營養(yǎng)豐富，有“維生素C之王”的美稱，深受消費者喜愛。貴州省修文縣是獼猴桃之鄉(xiāng)，種植面積達15萬hm2，掛果面積約為 3 330 hm2，產(chǎn)量超過4萬t。目前，未見有關(guān)新鮮健康獼猴桃果實分離到具抑菌活性菌株的報道。從高產(chǎn)的健康獼猴桃果實中分離鑒定內(nèi)生菌，研究其抑菌譜和抑菌活性，對獼猴桃天然抗菌物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用具有重要意義，可為獼猴桃產(chǎn)業(yè)深加工發(fā)展提供新的方向，也為其產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

獼猴桃果實采集于貴州省修文縣三金圣果有限公司獼猴桃園內(nèi)。大腸埃希氏菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)、白色念珠菌(ATCC10231)等標準菌株，由貴州醫(yī)科大學感染與免疫實驗室提供；大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、肺炎鏈球菌、溶血性葡萄球菌等臨床菌株，由貴州省六盤水市人民醫(yī)院檢驗科分離鑒定并保存。Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)，由青島雅各化學試劑有限公司提供；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，由鼎國生物技術(shù)有限公司提供；水解酪蛋白(Mueller-Hinton)培養(yǎng)基(MH培養(yǎng)基)，由杭州濱和微生物試劑有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 獼猴桃果實內(nèi)生細菌的分離純化 新鮮獼猴桃果實經(jīng)70%乙醇溶液表面消毒[10]，用接種針挑取果肉分別于PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長情況；轉(zhuǎn)種培養(yǎng)3次以純化菌株，4 ℃保存，備用。

1.2.2 獼猴桃果實內(nèi)生拮抗菌株的篩選 采用平板對峙法[16]，在直徑為9 cm的PDA平板中央接入鏈格孢菌；距中央2.5 cm處接入1環(huán)培養(yǎng)24～48 h的分離純化菌株菌苔，28 ℃ 培養(yǎng)3 d，以不接種菌株處理為對照，測定菌株對鏈格孢菌的抑菌活性。

1.2.3 分離菌株無菌發(fā)酵液的制備 在150 mL三角燒瓶中加入30 mL PDA液體培養(yǎng)基，接種內(nèi)生菌到三角燒瓶中，37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液4 ℃ 10 000 r/min離心10 min；取上清液，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min；上清液用0.45 μm的水系、微孔濾膜過濾除菌，即得無菌發(fā)酵濾液。

1.2.4 分離菌株無菌發(fā)酵液平板傾注法培養(yǎng) 將無菌發(fā)酵濾液分別稀釋0、2、4、8、16倍制成菌懸液，分別與MH培養(yǎng)基混勻；用0.5號麥氏比濁管分別將標準菌株、臨床菌株配制成孢子濃度為1.5×108CFU/mL的菌液，再用0.9%氯化鈉溶液(生理鹽水)稀釋成孢子濃度為1×105CFU/mL的菌液，接種在混勻的培養(yǎng)基表面，倒置于恒溫箱28 ℃中培養(yǎng)24～48 h，觀察其生長情況[12]。

1.2.5 內(nèi)生菌菌株的鑒定

1.2.5.1 生理生化特性鑒定[17]將保存的菌株復蘇，接種于血平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h；挑起單個菌落進行革蘭氏染色，油鏡(100×)下觀察細菌形態(tài)；根據(jù)革蘭氏染色情況，挑起上面培養(yǎng)的單個菌落，穿刺相應(yīng)乳酸、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、木糖、七葉苷、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、硝酸鹽、靛基質(zhì)、枸櫞酸鹽共13個生化管。

1.2.5.2 掃描電鏡形態(tài)觀察 取內(nèi)生菌1 mL發(fā)酵液，8 000 r/min 室溫離心1 min；棄上清，加入2.5%戊二醛，4 ℃冰箱中固定4～8 h，8 000 r/min室溫離心1 min；棄上清，磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)清洗3次，按30%、50%、70%、80%、90%順序梯度脫水，每次加入后靜置15 min，8 000 r/min室溫離心1 min；100%乙醇洗滌2次，用300～600 μL無水乙醇重懸浮，待用；吸取重懸液7～10 μL置于干燥儀內(nèi)干燥，將干燥好的樣品用雙面膠置于掃描電鏡專用樣品臺上，經(jīng)離子濺射噴金后在掃描電鏡下觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)[18]。

1.2.5.3 分子生物學鑒定 細菌菌株DNA的提取參照易潤華等的方法[19]，應(yīng)用16S rDNA進行PCR擴增；取5 μL擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，DNA目的條帶送上海生工生物工程有限公司進行測序，將所得的16S rRNA基因序列用Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行相似性比對，采用Mega 5.0軟件N-J法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果實內(nèi)生菌的菌落特征

由圖1可見，從獼猴桃果肉內(nèi)分離出3株植物內(nèi)生菌M1、M2、M3，經(jīng)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)生菌M1菌落形態(tài)為灰色，內(nèi)生菌M2菌落形態(tài)為黃褐色，內(nèi)生菌M3菌落形態(tài)為白色，3株內(nèi)生菌均表面粗糙，呈絨狀。

2.2 獼猴桃果實內(nèi)生菌拮抗菌株的篩選

試驗結(jié)果(圖2)表明，只接種鏈格孢菌的PDA平板(對照)上，鏈格孢菌占領(lǐng)整個平板，而在對峙接種M3和鏈格孢菌的平板上，鏈格孢菌則沒有越過M3，2種菌之間抑菌帶寬達0.5 cm，說明M3對鏈格孢菌絲生長有明顯抑制作用。

2.3 獼猴桃果實內(nèi)生菌株抑菌活性試驗

2.3.1 對標準菌株的抑菌效果 由圖3可見，M3無菌發(fā)酵濾液原液及其稀釋液對標準菌株大腸埃希氏菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)有較好的抑菌效果，未見這2種菌株的生長。

2.3.2 對臨床菌株的抑菌效果 由圖4、圖5可見，M3菌株無菌發(fā)酵液對革蘭氏陰性臨床菌株大腸埃希氏菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌有較好的抑菌效果，上述細菌在不同濃度內(nèi)生菌發(fā)酵液中均未見生長，而對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、肺炎鏈球菌的抑菌效果相對較差，上述細菌在不同濃度的內(nèi)生菌發(fā)酵液中均有不同程度的生長。

2.4 內(nèi)生菌株M3的鑒定

2.4.1 菌落形態(tài)觀察 由圖6、圖7可見，菌株M3在血瓊脂平板上的菌落形態(tài)為灰白色、不規(guī)則、略凸起、濕潤；革蘭氏染色為陰性，菌體呈球狀、桿狀、球桿狀。

2.4.2 電鏡形態(tài)觀察 由圖8可知，M3菌株孢子形態(tài)呈桿狀，大小為2.50 μm×0.20 μm左右。

2.4.3 生理生化鑒定 由圖9、表1和檢索伯杰氏細菌鑒定手冊可知，M3菌株的生理生化特性與堿桿菌屬較為接近。

2.4.4 分子生物學和生物信息學鑒定 以M3菌株的基因組DNA為模板，用細菌通用引物進行PCR擴增，得到1條約1 500 bp的DNA片段，用DNA回收試劑盒回收該片段進行測序，序列長度為1 478 b，該序列與GenBank中16S rDNA序列進行比對，M3菌株的16SrDNA與產(chǎn)堿桿菌菌屬的糞腸產(chǎn)堿桿菌同源性高達99.9%。由圖10可見，菌株M3與堿桿菌屬在同一分支上，遺傳進化距離相對最近，這與形態(tài)學觀察及生理特性的測定結(jié)果一致，可確定M3菌株屬糞產(chǎn)堿桿菌，命名為S1142的16S rDNA序列已在GenBank中注冊，序列號為HM145896.1。

3 結(jié)論與討論

本試驗從新鮮獼猴桃果實中分離到1株對革蘭氏陰性臨床菌株有抑菌活性的內(nèi)生細菌菌株M3，該菌株抗菌譜較廣，抑菌效果較好，通過生理生化反應(yīng)、革蘭氏染色、電鏡觀察、16S rDNA測序及分子生物學檢測，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定M3菌株屬于糞產(chǎn)堿桿菌。糞產(chǎn)堿桿菌一般常見由土壤中分離得到[20]，發(fā)現(xiàn)帶有多變異性的質(zhì)體，攜帶可制造酵素的基因，在生物工程中應(yīng)用很廣[21]，同時也廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)、廢水處理、去除農(nóng)藥有毒物質(zhì)等方面。

隨著抗生素的濫用，臨床耐藥菌的不斷出現(xiàn)向人類發(fā)起一輪又一輪的挑戰(zhàn)，以副作用小、安全性高的天然抗生素受到人們的青睞，國內(nèi)外關(guān)于天然抑菌物質(zhì)的抑菌研究近年來成為熱門。早在10多年前，趙躍等提出探索植物天然抗菌素作為新的治療因子應(yīng)用于臨床及藥物開發(fā)的建議[22]。李楊等從梧桐科蛇婆子屬植物中得到一個獨特的喹啉酮生物堿，初步發(fā)現(xiàn)其甲基化衍生物對革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等有抗菌活性[23]。楊澍等從魚腥草中分離出對體外金黃色葡萄球菌和白色念珠菌、對體內(nèi)金黃色葡萄球菌有明顯抑制菌作用的有效成分魚腥素[24]。本試驗在獼猴桃果實中分離得到M3菌株，在醫(yī)學天然抗菌物質(zhì)的應(yīng)用將會有重要的研究價值。M3菌株發(fā)酵液在平板對峙試驗中對鏈格孢菌有很強的拮抗能力；在平板傾注法中，能明顯抑制標準菌株大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌；在臨床菌株抑制試驗中，革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷柏菌均未見生長，在不同濃度M3菌株發(fā)酵液中，革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、 溶血性葡萄球菌、肺炎鏈球菌有不同程度的生長，進一步證實獼猴桃內(nèi)生菌M3菌株發(fā)酵菌液對革蘭氏陰性菌有抑菌作用，對革蘭氏陽性菌無明顯的抑菌作用。

表1 M3菌株生化鑒定結(jié)果

注：-表示呈陰性；+表示呈陽性。