杜 浩，張 彬，黃 萍，3，杜道林，3，莊義慶

(1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇句容 212013；3.江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程研究院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

甜高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]起源于非洲，是一種C4植物，由于生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高、植物莖干含糖量高且具有較強(qiáng)的耐鹽堿、抗旱、耐高溫等特點(diǎn)，適宜在鹽堿灘涂及干旱等邊際土壤大規(guī)模種植，因此也被譽(yù)為“作物中的駱駝”。我國鹽堿地面積約為9 913萬hm2，且鹽堿化和次生鹽堿地面積逐年增加[1]。而江蘇省沿海灘涂總面積居全國首位，并且以每年1 333 hm2的速度增長(zhǎng)[2]。研究甜高粱的耐鹽性，充分利用這些邊際性土地發(fā)展甜高粱生物質(zhì)能源，可以有效緩解我國耕地面積緊缺和糧食安全壓力，也符合“不與人爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地”的政策。因此，篩選耐鹽堿甜高粱品種(系)具有十分重要的意義。

本試驗(yàn)以不同濃度的鹽脅迫(NaCl)處理對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響程度為指標(biāo)，對(duì)4個(gè)甜高粱品種(系)發(fā)芽期耐鹽性進(jìn)行初步的鑒定與評(píng)價(jià)，旨在為甜高粱耐鹽性研究和品種篩選提供更多理論依據(jù)，進(jìn)而為江蘇沿海灘涂甜高粱品種的選擇提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于研究的4個(gè)甜高粱品種(系)分別為大力王(DLW)、牛魔王(NMW)、海牛(HN)和帕卡(PK)，均購自鄭州華豐草業(yè)有限公司。選取籽粒飽滿、大小均一的種子備用。NaCl試劑由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，MS培養(yǎng)基購自上海宇涵生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子預(yù)處理 選取顆粒飽滿、大小均一的DLW、NMW、HN和PK種子，在37 ℃通風(fēng)放置7 d后統(tǒng)一置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ?% NaClO進(jìn)行表面消毒20 min，然后用無菌水清洗3～5遍，在無菌操作臺(tái)中，接種于含有不同濃度NaCl的MS固體培養(yǎng)基上。

1.2.2 鹽脅迫處理 配制1 mol/L NaCl母液，在MS固體培養(yǎng)基中分別添加至NaCl終濃度為0、80、160、240 mmol/L，121 ℃ 高溫滅菌20 min后搖勻，待冷卻至50～60 ℃倒入 9 cm 培養(yǎng)皿中放置冷卻凝固，然后將消毒處理后的種子接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)培養(yǎng)皿接10粒種子，每個(gè)品種4個(gè)處理，每個(gè)處理7個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)皿置于25～28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照時(shí)間14 h/d。

1.2.3 種子發(fā)芽指標(biāo)的測(cè)定 種子發(fā)芽能力的檢測(cè)參照GB/T 3543.4—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 發(fā)芽試驗(yàn)》，按以下公式計(jì)算萌發(fā)率：

種子萌發(fā)率=N1/N×100%。

式中：N1為全部正常發(fā)芽種子數(shù)，粒；N為供試種子數(shù)，粒。種子發(fā)芽以胚根突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)芽期間每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，共計(jì)8 d。

1.2.4 形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后15 d測(cè)定幼苗的根長(zhǎng)、株高以及干質(zhì)量。

平均根長(zhǎng)和株高：種子發(fā)芽15 d后，將幼苗從培養(yǎng)皿中取出洗凈，用吸水紙吸去水分，進(jìn)行拍照，以標(biāo)尺作為對(duì)照。從每個(gè)處理的7個(gè)重復(fù)中各取20株幼苗，用Image J軟件測(cè)出根長(zhǎng)和株高，取平均值。

干質(zhì)量：種子發(fā)芽后15 d，將幼苗從培養(yǎng)皿中取出，在 110 ℃ 殺青2 h，然后放入65 ℃烘箱內(nèi)烘至恒質(zhì)量，待冷卻至室溫后用FA1604電子天平稱取植株的干質(zhì)量，并記錄。

1.3 生化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定 采用硫代巴比妥酸法[3]測(cè)定。取上清液在Infinite M1000 PRO(TECAN)下分別測(cè)定600、532、450 nm下的吸光度。

1.3.2 脯氨酸含量的測(cè)定 參照酸性茚三酮法[4]測(cè)定，并對(duì)過程稍作優(yōu)化。

1.3.3 保護(hù)酶活性的測(cè)定 過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[5]，用Infinite M1000 PRO(TECAN)在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，以1 min內(nèi)D470 nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位。

過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定采用紫外吸收法[6]，用Infinite M1000 PRO(TECAN)在240 nm下測(cè)量吸光度，以 1 min 內(nèi)D240 nm減少0.1為1個(gè)酶活性單位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)植物拍照后，采用Image J軟件測(cè)量根長(zhǎng)和株高；采用SPSS 22.0軟件，利用差異分析法(即LSD法)進(jìn)行分析；利用Origin 9.1對(duì)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)甜高粱生長(zhǎng)的影響

對(duì)4個(gè)品種的甜高粱進(jìn)行耐鹽試驗(yàn)，結(jié)果表明鹽脅迫處理能明顯抑制甜高粱種子的萌發(fā)，并且隨著鹽濃度的增加，不同品種甜高粱種子的萌發(fā)率均逐漸降低(圖1、圖2)。在正常情況下(無鹽脅迫)，DLW、NMW、HN品種之間無顯著差異，萌發(fā)率接近100%，PK萌發(fā)率約為90%。在低濃度鹽脅迫(80 mmol/L)處理下，不同甜高粱品種之間的萌發(fā)率差異不明顯，與正常情況相比，DLW、NMW、HN的萌發(fā)率無明顯差異。而高濃度鹽脅迫(160 mmol/L)處理使不同甜高粱品種的萌發(fā)率均受到明顯抑制。在高濃度鹽脅迫(160 mmol/L)處理下，DLW萌發(fā)率降低76%，NMW萌發(fā)率降低10%，HN和PK的萌發(fā)率幾乎為0(圖1、圖2)。

植物根系是吸收礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和水分的重要器官，是鹽脅迫原初效應(yīng)的發(fā)生部位，對(duì)地上部分的生命活動(dòng)以及整個(gè)植株的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用[7]。由圖3可以看出，NaCl對(duì)根長(zhǎng)具有抑制作用，4個(gè)甜高粱品種的根長(zhǎng)均隨著鹽濃度的升高而減小。在正常情況下(無鹽脅迫)，不同品種甜高粱的根長(zhǎng)并無顯著差異，但當(dāng)鹽脅迫濃度為80 mmol/L時(shí)，不同品種甜高粱根長(zhǎng)的相對(duì)減少量不同，NMW根長(zhǎng)降幅最小，減少 35.90%，其次是DLW、PK，分別減少43.58%、43.63%，最后是HN，減少71.24%。當(dāng)鹽脅迫濃度為160 mmol/L時(shí)，DLW、NMW的根長(zhǎng)與正常情況下(無鹽脅迫)相比，分別減少89.67%、86.30%，而HN和PK的根長(zhǎng)生長(zhǎng)完全受到抑制(圖3)。

鹽脅迫對(duì)株高的抑制作用與對(duì)根長(zhǎng)的抑制作用類似，由圖4可以看出，隨著鹽脅迫濃度的增加，不同品種的株高均呈下降趨勢(shì)，但不同品種之間存在差異。與正常情況(無鹽脅迫)相比，低濃度(80 mmol/L)的鹽脅迫處理使PK的株高減少43.4%，其次是HN(減少40.8%)，最后是NMW(減少36.6%)和DLW(減少24.6%)，且NMW和DLW兩者之間無顯著差異。而當(dāng)鹽脅迫濃度為160 mmol/L時(shí)，DLW的株高顯著高于NMW(P<0.05)，而HN和PK的生長(zhǎng)則完全被鹽脅迫抑制。

2.2 鹽脅迫對(duì)甜高粱生物量的影響

由圖5可以看出，在正常情況(無鹽脅迫)下，NMW的干質(zhì)量顯著高于其他3個(gè)品種，DLW、HN、PK之間差異不顯著。隨著鹽脅迫濃度的增加，不同品種甜高粱的干質(zhì)量均顯著降低(P<0.05)，其中NMW較其他3個(gè)品種的干質(zhì)量減少的最少，DLW干質(zhì)量減少的較少，其次是HN，PK減少的最多。NMW在不同鹽脅迫下的干質(zhì)量均顯著高于其他3個(gè)品種(P<0.05)。在低濃度(80 mmol/L)鹽脅迫下，DLW、HN、PK 3個(gè)品種干質(zhì)量差異不顯著，而在高濃度(160 mmol/L)鹽脅迫下，DLW的干質(zhì)量要顯著高于HN(P<0.05)。

2.3 鹽脅迫對(duì)甜高粱抗氧化系統(tǒng)的影響

丙二醛是細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用的終產(chǎn)物，其含量多少可以衡量細(xì)胞膜受損傷的程度[8]。由圖6可以看出，隨著鹽濃度的變化，各品種甜高粱MDA含量變化趨勢(shì)基本一致，都是先升高后降低。在正常情況(無鹽脅迫)下，NMW的葉片MDA含量顯著低于其他3個(gè)品種(P<0.05)，而且在0.80 mmol/L鹽濃度脅迫處理下均處于最低水平。在低濃度鹽脅迫處理下(80 mmol/L)，各品種MDA含量均顯著上升，且不同品種之間無顯著差異。當(dāng)鹽脅迫濃度為 160 mmol/L 時(shí)，DLW和NMW的MDA含量均明顯下降，且DLW的MDA含量顯著高于NMW(P<0.05)。

脯氨酸是植物在鹽脅迫下產(chǎn)生的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有助于細(xì)胞或組織的保水，同時(shí)還可作為碳水化合物來源以及酶和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保護(hù)劑[9-10]。由圖7可以看出，隨著鹽脅迫濃度的升高，4個(gè)品種甜高粱的脯氨酸含量均呈明顯上升趨勢(shì)。與正常情況(無鹽脅迫)相比，當(dāng)鹽脅迫濃度為 80 mmol/L 時(shí)，PK和HN脯氨酸含量上升幅度顯著高于其他2個(gè)品種，分別升高3.87倍和3.57倍；而NMW和DLW則分別上升2.72倍和2.41倍。當(dāng)鹽濃度為160 mmol/L時(shí)，與無鹽脅迫相比，NMW和DLW脯氨酸含量急劇增加，分別增加20.5倍和9.8倍。

2.4 鹽脅迫對(duì)植物保護(hù)酶系統(tǒng)的影響

過氧化氫酶是膜保護(hù)系統(tǒng)的一種酶，能夠在逆境脅迫中清除植物體內(nèi)的過氧化氫，減少氧自由基的形成，維持體內(nèi)的活性氧代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，減輕有毒物質(zhì)對(duì)生活細(xì)胞的毒害，延遲或阻礙細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使組織保持活力[11]。過氧化物酶作為自由基清除劑，其活性提高也可以減輕自由基對(duì)膜的傷害[12]。由圖8、圖9可以看出，隨著鹽脅迫的增加，CAT和POD活性均先升高后降低，不同品種(系)甜高粱變化趨勢(shì)不同。與正常情況(無鹽脅迫)相比，在低濃度(80 mmol/L)鹽脅迫處理下，除了NMW，其他3個(gè)品種的CAT活性均有所升高，其中HN活性最高，其次是PK，最后是DLW。低濃度鹽脅迫處理下DLW的POD活性最高，其次是PK和HN。高濃度(160 mmol/L)的鹽脅迫處理使不同甜高粱品種的抗氧化酶系統(tǒng)均受到了不可逆的損傷，DLW和NMW的酶活性均急劇下降(圖8、圖9)。

3 討論與結(jié)論

在鹽脅迫中，種子最先也最容易受到鹽害作用[13]。不同品種(系)甜高粱的萌發(fā)率是表征耐鹽性的重要依據(jù)之一。在鹽脅迫下種子的萌發(fā)情況與植物本身的耐鹽性有一定關(guān)系[14]，從萌發(fā)率來看，NMW耐鹽性最強(qiáng)，其他品種依次是DLW、HN、PK。

根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)是影響植物耐鹽性的一個(gè)重要因素，根系的生長(zhǎng)對(duì)地上部分和干質(zhì)量具有重要影響。當(dāng)根部鹽脅迫增強(qiáng)時(shí)，高濃度的鹽產(chǎn)生較高的滲透壓，因此地上部分的生長(zhǎng)率就會(huì)顯著減少[15]。柴媛媛等認(rèn)為，相對(duì)根長(zhǎng)和相對(duì)芽長(zhǎng)數(shù)值越大說明耐鹽性越強(qiáng)[16]。綜合考慮根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)及干質(zhì)量的相對(duì)與絕對(duì)生長(zhǎng)量，本試驗(yàn)結(jié)果表明，幼苗的耐鹽性排序依次是NMW>DLW>PK>HN。

在正常條件下，細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，平衡體系的破壞導(dǎo)致自由基的積累，從而使膜內(nèi)磷脂雙分子層中含有的不飽和脂肪酸鏈易于被過氧化分解，造成膜整體的破壞[11]。POD和CAT均是植物體內(nèi)的自由基清除劑，屬于保護(hù)酶系統(tǒng)。一般情況下，鹽脅迫下保護(hù)酶活性增強(qiáng)，使體內(nèi)的活性氧自由基保持在較低的水平，在一定的鹽脅迫下防止生物膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞。

本試驗(yàn)中，低濃度(80 mmol/L)鹽脅迫處理下，不同品種甜高粱MDA含量均明顯升高，說明植物受到了鹽害作用。與之對(duì)應(yīng)的，CAT和POD 2種抗氧化酶的活性升高，表明鹽害刺激引起了甜高粱體內(nèi)的抗氧化保護(hù)機(jī)制，機(jī)體內(nèi)清除活性氧的機(jī)制啟動(dòng)，保護(hù)植物不受鹽分損傷。與此同時(shí)，不同品種甜高粱脯氨酸含量的增加，說明甜高粱通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的提高來增強(qiáng)細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，以減少鹽離子對(duì)植物細(xì)胞造成的損傷。當(dāng)鹽濃度達(dá)到160 mmol/L時(shí)，HN和PK均不能萌發(fā)，而NMW和DLW根長(zhǎng)、株高、生物量都受到了明顯的抑制，并且抗氧化酶系統(tǒng)也受到了破壞，活性降低，雖然脯氨酸含量均急劇升高，卻不能抑制這種不可逆的損傷。脯氨酸不僅具有滲透壓調(diào)節(jié)功能，還是活性氧清除劑，因而在脅迫條件下可能起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)和膜結(jié)構(gòu)的作用[17-18]。這可能是NMW在相同濃度鹽脅迫下，其酶活性較低而生物量較高的一個(gè)原因。

從不同品種甜高粱在不同鹽濃度下的萌發(fā)率、根長(zhǎng)、株高、干質(zhì)量、MDA含量、脯氨酸含量及保護(hù)酶活性的變化可以看出，NMW相對(duì)其他品種的耐鹽性最強(qiáng)，其次是DLW，而PK和HN易受鹽脅迫影響。當(dāng)鹽脅迫濃度較低時(shí)，保護(hù)酶活性升高及滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)的增加有利于甜高粱品種耐鹽性的提高，而當(dāng)鹽脅迫濃度較高時(shí)，植物的保護(hù)酶系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆損傷，此時(shí)滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)保護(hù)植物起到重要的作用。