李莉梅，歐陽樂軍，尹愛國，韓寒冰，陳凱釗，布良灝，孫同川

(廣東石油化工學院，廣東茂名 525000)

CRISPR/Cas9基因組定向編輯技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的對基因組進行定向精確修飾的一種技術(shù)。通過將外源DNA導入受體細胞染色體的特定位點上，從而特異地改造基因組，研究基因的功能。該技術(shù)可以對基因組中的靶位點進行缺失、敲入、核苷酸修正等操作。2013年，科學家首次將CRISPR/Cas9應(yīng)用到人類和小鼠細胞系中對基因進行敲除[1]，隨后人們在模式植物和其他農(nóng)作物中也成功獲得了應(yīng)用，經(jīng)過改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)也迅速地被應(yīng)用到擬南芥、煙草、高粱、水稻、小麥、玉米等不同植物基因組的定向編輯研究中，并且獲得較高的誘導突變率和可穩(wěn)定遺傳的基因組編輯植株[2-3]。相對于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡單、快捷、不需要巨大的資金投入、在遺傳編輯之后不留下轉(zhuǎn)基因的痕跡等優(yōu)點，無需引用外源基因，因而生物安全性高，不具有轉(zhuǎn)基因爭議。

目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用存在表達活性不高以及單位點基因編輯后代的酶切檢測繁瑣等問題[4]。要想設(shè)計高效率的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，要考慮到該系統(tǒng)表達的時間、空間以及效率等幾個方面。目前多數(shù)CRISPR載體都只有1個sgRNA，只能靶向基因的1個位點，有時基因突變的效率并不高，這是因為預(yù)測sgRNA效率的體系和方法還不是很完善。多個sgRNA能夠靶向同一基因的不同位點，提高基因突變的頻率；也能造成較大片段的缺失突變，也利于突變后代的PCR方法篩選檢測。另外，多個sgRNA也能靶向不同的基因，特別是同一信號通路、同一代謝途徑或同一基因家族的基因，在基礎(chǔ)生命科學研究中具有重要的應(yīng)用價值。本研究以細胞分裂素氧化/脫氫酶基因(cytokinin oxidase/dehydrogenase，CKX)為目標基因，以PHDE-35S-Cas9為基礎(chǔ)載體，通過3輪PCR反應(yīng)，建立將2個sgRNA串聯(lián)到同一個CRISPR載體中的方法體系，可同時連接2個target片段，突變效率高，突變后代鑒定簡單，無須進行酶切鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

細菌培養(yǎng)基(LB)的制備：酵母提取粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，加30 g瓊脂，用蒸餾水定容至1 000 mL。CRISPR/Cas9表達載體PHDE-35S-Cas9由加州大學圣地亞哥分校Professor Zhao提供；大腸桿菌DH5α以及農(nóng)桿菌GV3101菌株由筆者所在實驗室保存；普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA聚合酶、MFEⅠ內(nèi)切酶、Pfu DNA Polymerase、T4DNA Ligase均購自鼎國生物(廣州)有限公司；DNA分子量MarkⅢ購自廣州東盛生物科技有限公司；引物合成及基因測序在上海生物工程有限公司完成。PCR儀購自德國Biometra公司；離心機購自德國Eppendorf公司；電泳儀購自北京市六一儀器公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；金屬振蕩培養(yǎng)箱購自哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；超凈工作臺購自江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 sgRNA靶位點的選擇與設(shè)計 使用CRISPR在線設(shè)計工具(http：//crispr.dbcls.jp/)，以CKX基因為靶基因，選擇靠近5′端得分最高的G-N19-NGG 23 bp序列，其中第一個G是小RNA轉(zhuǎn)錄的起始信號位點，NGG是Cas9基因定位的PAM序列，需要插入gRNA載體的是G-N19共20 bp序列。靶序列的選擇原則：盡可能選擇2個target的目的片段長度大于1 000 bp，以增加目標基因敲除效果；靶序列必須在全基因組中比對且唯一，否則會形成錯誤切割，影響試驗結(jié)果；選擇高G+C含量的靶位點，增加向?qū)gRNA和DNA結(jié)合穩(wěn)定性，從而提高切割效率，減少脫靶效應(yīng)的發(fā)生[5]。

1.2.2 含target片段的PCR擴增 以PHDE-U6-26-29質(zhì)粒為模板，第1輪PCR分別擴增26端與29端的全長，再以26端與29端PCR回收產(chǎn)物為模板擴增26+29的全長，其中26端與29端分別含有1個與目標基因匹配的target序列，PCR擴增反應(yīng)體系如下：PHDE-U6-26-29 1 μL(模板)；Pfu酶2.5 μL；ddH2O 74.5 μL；dNTP 10 μL；Buffer 10 μL；Primer F 1 μL(正向引物)；Primer R 1 μL(反向引物)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃ 2 min。PCR產(chǎn)物的回收純化參照天根生化科技(北京)有限公司的DNA回收純化試劑盒進行。

PCR所需引物序列如下：

U6-29P5：GCAGTTCCGATGAGATAAACCAATACGTTC-TTAATCCAAACTACTGCAGC；

U6-29-F：GGTGAGGCCTCTGTCGACTTGTTTTAGAGC-TAGAAATAGCAAGTTA；

U6-29P3：AGACCAAGCTTCACTTCATCCTTGGCATAT-AAATGTCCCATGAG；

U6-29-R：AAGTCGACAGAGGCCTCACCAATCTCTTA-GTCGACTCTACC；

U6-26P5：GGCTGCAGGTCGACGCGTCCGACTTGCCT-TCCGCACAATAC；

U6-26-F：GATCAGCAATGTCTACGAAAGTTTTAGAGC-TAGAAATAGCAAGTTA；

U6-26P3：GCTGCAGTAGTTTGGATTAAGAACGTATTGG-TTTATCTCATCGGAACTGC；

U6-26-R：TTTCGTAGACATTGCTGATCAATCACTACT-TCGACTCTAG。

1.2.3 含target片段的PCR產(chǎn)物與載體連接 將上述“1.2.1”節(jié)擴增的26-29最終PCR產(chǎn)物與經(jīng)MFEⅠ酶切 PHDE-EC2-Cas9載體在PCR儀中50 ℃連接1 h，經(jīng)同源重組將含2個target的26-29 unity目的片段與載體相連。連接體系如表1所示。

表1 表達載體連接反應(yīng)體系

1.2.4 轉(zhuǎn)化與重組載體鑒定 將上述“1.2.2”節(jié)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌與單克隆篩選，經(jīng)菌液PCR鑒定后，提取質(zhì)粒DNA備用。堿法小量提取質(zhì)粒DNA，送樣測序鑒定與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶位點的選擇

針對CKX基因序列，遵循以NGG的PAM序列上游 20 bp 為靶序列的原則，在目標基因的不同區(qū)域?qū)ふ?個靶位點，2個靶點分別位于CKX基因不同外顯子上，2個靶序列間隔大約在1 000 bp，target Sequence(5′→3′)的具體信息如下：

target1：GGTGAGGCCTCTGTCGACTTTGG；

target2：GATCAGCAATGTCTACGAAATGG。

下劃線是PAM序列。

2.2 含target的插入片段PCR擴增

2.2.1 26和29的3′與5′片段擴增 質(zhì)粒PHDE-U6-26-29為模板，用U6-26-5(3)P和U6-26-5(3)R為正向和反向引物，擴增得到300 bp左右的26-3′與5′端，同時，以PHDE-U6-26-29為模板，用U6-29-5(3)P和U6-29-5(3)R為正向和反向引物，擴增得到29-3′與5′端(圖1、圖2)。

2.2.2 26 unity與29 unity全長片段的擴增 用“2.2.1”節(jié)中26(29)的3′與5′PCR回收產(chǎn)物為模板，以U6-26(29)-5P與U6-26(29)-3p為正向與反向引物，擴增得到600 bp左右的26 unity和29 unity全長片段(圖3)。

2.2.3 26+29的全長unity片段擴增 用“2.2.2”節(jié)中26 unity和29 unity全長片段，以U6-26-5P與U6-29-3p為正向與反向引物，擴增得到26+29全長unity片段(圖4)。

2.3 重組載體構(gòu)建連接

將上述“2.2.2”節(jié)的最終26+29 unity PCR產(chǎn)物與經(jīng)MFEⅠ酶切PHDE-EC2-Cas9載體在PCR儀中50 ℃連接 1 h，經(jīng)同源重組將含2個target的26-29 unity目的片段與載體相連。將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞，再將轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在含卡那霉素的平板上培養(yǎng)，挑選部分單菌落進行培養(yǎng)，4 h后進行菌液PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖5所示，轉(zhuǎn)化陽性率達到100%。

2.4 序列測定

提取菌液PCR擴增為陽性質(zhì)粒，以U6-F為引物測序，經(jīng)送樣測序結(jié)果比對，證實26+29的全長片段擴增并組裝到PHDE-35S-Cas9成功(圖6)，該插入片段含2個target序列，與預(yù)期設(shè)計完全一致(圖7)。

3 結(jié)論與討論

CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1987年，但是CRISPR-Cas9這種技術(shù)的應(yīng)用研究還處于初始階段，是近幾年才逐漸發(fā)展起來的[6]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種有效的基因編輯工具，具有操作簡單、高效性、特異性等其他基因編輯工具所不具備的優(yōu)勢，近年來迅速被世界各大實驗室運用。該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用在多種微生物、動物和植物[7]。2013年《Nature Biotechnology》同時報道了在重要作物水稻、小麥以及模式植物擬南芥和煙草中取得了多個基因定點敲除、插入等基因組定點編輯操作的成功案例，并首次證實CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在植物基因組中實現(xiàn)定點編輯[8]。

對于靶位點的選擇，主要參考在線工具CRISPR Design或E-Crispr[9]，以NGG為PAM序列原則，在目標基因序列中選擇含20個堿基的靶點，并在全基因組中掃描潛在的脫靶位點和脫靶效率，經(jīng)過綜合評價，將靶點按照得分高低排列，選擇最合適的靶點。CRISPR Design網(wǎng)站提供脫靶位點相關(guān)信息，而E-Crispr網(wǎng)站不提供具體的脫靶數(shù)據(jù)。通常1個目標基因至少選擇2個不同靶點。本研究以巨桉細胞分裂素氧化酶基因CKX基因為目標基因，分別選擇2個不同靶點，可實現(xiàn)1個基因2個位點的大片段敲除。Gao等創(chuàng)造性地將2個gRNA對同一個基因進行大片段切除，使得對基因編輯事件的檢測只需要進行簡單的PCR分析[10]，極大地減少了工作量，提高了效率。

這種同一基因選取2個目標位點經(jīng)Cas9酶切，造成突變后可得到大片段缺失突變，在后續(xù)突變后代檢測時，在突變基因2個target位點上、下游設(shè)計2條引物進行PCR擴增，野生型是得到1條大帶，目的基因沒有缺失；純合突變的電泳結(jié)果是只有1條小帶，目的基因因中間有大片段缺失，以此為模板擴增得到的片段比野生型要小；對于二倍體生物，如果2條同源染色體中的1對等位基因只有1條被Cas9酶成功切割，另外一條沒有發(fā)生切割，則會出現(xiàn)2條帶，說明2個等位基因只有1個突變成功，用該基因組作為模板可擴增得到2條大小不同的條帶。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)在基因組編輯中的應(yīng)用越來越廣泛，為人們定點改造動植物甚至人類基因組提供了可能。串聯(lián)多個sgRNA表達框是進一步提高CRISPR/Cas9技術(shù)效率的重要途徑[11]。另外，目前已經(jīng)出現(xiàn)了一些靶位點設(shè)計和活性檢測的方法，科學選擇靶位點也能增強sgRNA的穩(wěn)定性和活性，提高CRISPR/Cas9技術(shù)的基因組編輯效率[12-15]。

桉樹是南方重要的工業(yè)用材林樹種，具有良好的經(jīng)濟及生態(tài)社會效益。近些年，隨著桉樹再生及轉(zhuǎn)化體系的高效建立以及基因工程技術(shù)的成功應(yīng)用，為定向改良基因組成、研究相關(guān)基因功能奠定了基礎(chǔ)[16-18]。應(yīng)用高效的基因組定向編輯的CRISPR/Cas9技術(shù)體系，不用引入外源基因，不存在轉(zhuǎn)基因爭議，生物安全性高，為桉樹材質(zhì)改良、抗性育種提供了一種具有廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)體系[19-20]。本研究基于已測序的巨桉基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，以巨桉分裂素氧化酶基因CKX為研究對象，借助基因編輯工具CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功構(gòu)建了重組敲除載體PHDE-CKX-35S-cas9，為首次開展CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)對桉樹基因組定向編輯奠定基礎(chǔ)。與其他構(gòu)建多重sgRNA載體的方法相比，采用同源重組的方法直接將PCR擴增到的插入片段與載體相連，且PCR產(chǎn)物也無須經(jīng)專門的回收試劑盒進行回收，只需將切膠回收的條帶放入-20 ℃冰箱冷凍20 min左右，15 000 r/min離心10 min后可直接取上清液與載體連接，整個過程只需連接1 h，一次構(gòu)建成功的概率達到100%，因此，本研究這種構(gòu)建大片段敲除目標基因的CRISPR/Cas9載體構(gòu)建方法具有快速、高效等優(yōu)點。