謝靜 高云云 朱形好

硝苯地平致藥物性牙齦增生（DGO）是由于長(zhǎng)期服用硝苯地平引起的牙齦纖維數(shù)量增多和體積增大，為臨床常見的牙周疾病，致病率為15%～85%，國(guó)內(nèi)有報(bào)道為20.8%［1］。研究顯示大蒜素具有抗纖維化作用，可抑制成纖維細(xì)胞增殖、減少膠原分泌。既往研究發(fā)現(xiàn)將大蒜素作用于體外培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞，顯示其對(duì)Ⅰ型膠原的合成及分泌有抑制作用，提示大蒜素有抗牙齦纖維化作用［2］。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是致纖維化過(guò)程中的重要因子［3-4］。2015年5月至2016年10月作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究探討大蒜素對(duì)硝苯地平致DGO患者牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）I型膠原分泌與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）主要試劑：大蒜素注射液：山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司?？共ㄐ谓z蛋白抗體、角蛋白抗體、SABC試劑盒、人Ⅰ型膠原、TGF-β1ELISA試劑盒：武漢博士德公司。MTT、DMSO：Sigma公司。高糖型DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶：美國(guó)Gibco公司。ELX800酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Tek公司。（2）樣本來(lái)源：經(jīng)患者同意，選取本院經(jīng)牙周情況評(píng)價(jià)牙齦增生（gingival overgrowth，GO）指數(shù)分別為1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)的硝苯地平致DGO患者各1例。3例患者年齡50～60歲，規(guī)則服用硝苯地平片2～6年，無(wú)糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等其他全身性疾病史，6個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行牙周治療。（GO指數(shù)使用Pernu等的標(biāo)準(zhǔn)［5］：0：無(wú)牙齦增生；1：牙齦邊緣輕度增厚或表面有明顯的顆粒和肉芽；2：增生的牙齦達(dá)到牙冠的1/2；3：增生的牙齦覆蓋牙冠的2/3，影響整個(gè)附著齦。）經(jīng)牙周基礎(chǔ)治療后行齦切術(shù)，收集各例切除的增生牙齦組織分別用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：采用組織塊貼壁法對(duì)增生牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，抗波形絲蛋白、角蛋白染色法進(jìn)行細(xì)胞鑒定，酶消化法常規(guī)傳代，取第5代增生牙齦成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。（2）藥物濃度及分組：MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，依據(jù)大蒜素濃度分為4組：空白對(duì)照組（加等量不含大蒜素的培養(yǎng)液）；3μg/ml大蒜素組；6μg/ml大蒜素組；9μg/ml大蒜素組。每孔設(shè)6個(gè)復(fù)孔。（3）Ⅰ型膠原、TGF-β1含量測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第5代增生牙齦成纖維細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)24h，按不同大蒜素濃度分別更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h，收集培養(yǎng)液用于標(biāo)本含量測(cè)定。操作步驟按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀于450nm處讀取OD值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測(cè)樣本Ⅰ型膠原、TGF-β1的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，相同大蒜素濃度時(shí)不同增生程度牙齦間（GO=1、GO=2、GO=3）I型膠原含量比較采用協(xié)方差分析。I型膠原抑制率=（1-試驗(yàn)組I型膠原值/對(duì)照組I型膠原值）×100%，TGF-β1抑制率 =（1-試驗(yàn)組 TGF-β1值 /對(duì)照組TGF-β1值）×100%。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GO=1時(shí)不同濃度大蒜素對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞分泌I型膠原及TGF-β1的影響 GO=1時(shí)不同濃度大蒜素對(duì)藥物增生牙齦成纖維細(xì)胞分泌I型膠原、TGF-β1有抑制作用（見表1）。采用Pearson相關(guān)分析法計(jì)算GO=1時(shí)I型膠原與TGF-β1的相關(guān)系數(shù)r=0.561（P=0.004）。

表1 GO=1時(shí)不同濃度大蒜素對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞分泌I型膠原及TGF-β1的影響（x±s）

2.2 GO=2時(shí)不同濃度大蒜素對(duì)藥物增生牙齦成纖維細(xì)胞分泌I型膠原、TGF-β1的影響 采用Pearson相關(guān)分析法計(jì)算GO=2時(shí)I型膠原與TGF-β1的相關(guān)系數(shù) r=0.823（P=0.000）。見表 2。

表2 GO=2時(shí)不同濃度大蒜素對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞分泌I型膠原及TGF-β1的影響（x±s）

2.3 GO=3時(shí)不同濃度大蒜素對(duì)藥物增生牙齦成纖維細(xì)胞分泌I型膠原、TGF-β1的影響 采用Pearson相關(guān)分析法計(jì)算GO=3時(shí)I型膠原與TGF-β1的相關(guān)系數(shù) r=0.877（P=0.000）。見表 3。

表3 GO=3時(shí)不同濃度大蒜素對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞分泌I型膠原及TGF-β1的影響（x±s）

3 討論

牙齦組織中基質(zhì)合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡是維持正常牙齦形態(tài)和結(jié)構(gòu)的重要前提。牙齦增生的發(fā)生發(fā)展使牙周組織喪失這種動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞外基質(zhì)尤其是I型膠原大量分泌并積聚，使牙周的內(nèi)環(huán)境受到破壞。研究顯示大蒜素有抗纖維化作用，可抑制成纖維細(xì)胞的增殖、減少細(xì)胞膠原的合成與分泌等［6］。作者既往研究也顯示大蒜素對(duì)內(nèi)毒素作用下體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞I型膠原的合成及分泌具有抑制作用［7］。本資料結(jié)果顯示：不同濃度大蒜素對(duì)不同嚴(yán)重程度患者增生牙齦成纖維細(xì)胞的I型膠原的分泌均有抑制作用，且此抑制作用隨大蒜素濃度的提高而愈加明顯，具有劑量依賴效應(yīng)，但兩兩比較結(jié)果顯示各濃度組間的差異并非均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO=1時(shí)，3μg/ml組與對(duì)照組比較（P=1.000）、6μg/ml組與3μg/ml組比較（P=0.077）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示對(duì)于輕度牙齦增生患者而言，低等濃度（3μg/ml）的大蒜素抑制I型膠原分泌的效果不明顯，而中等濃度（6μg/ml）組雖然與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較低等濃度（3μg/ml）組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示對(duì)于輕度牙齦增生，大蒜素的濃度梯度帶來(lái)的抑制效果差異不明顯，且需要較高的濃度才可以獲得抑制作用。這一點(diǎn)從各組的抑制率上也有所體現(xiàn)。GO=2時(shí)兩兩比較結(jié)果顯示3μg/ml組與6μg/ml組比較（P=0.071）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GO=3時(shí)兩兩比較結(jié)果顯示各組間比較結(jié)果差異均由統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示隨著牙齦增生程度的加重，大蒜素的濃度梯度帶來(lái)的抑制效果差異也越顯著。針對(duì)各濃度組上的基線值而言，牙齦增生越重（即GO指數(shù)越高）的患者，其成纖維細(xì)胞分泌的I型膠原越多，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），不同程度增生牙齦間（GO=1、GO=2、GO=3）兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。采用協(xié)方差分析法扣除對(duì)照組基線差異后分析相同濃度的大蒜素對(duì)不同程度牙齦增生患者的I型膠原分泌抑制作用顯示：大蒜素濃度為3μg/ml或6μg/ml時(shí)，牙齦增生越嚴(yán)重，大蒜素對(duì)I型膠原分泌的抑制作用越明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩個(gè)濃度點(diǎn)上不同程度增生牙齦間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示低、中等濃度大蒜素對(duì)不同程度增生牙齦的I型膠原分泌的抑制作用不同，增生程度越高，抑制作用越顯著；大蒜素濃度為9μg/ml時(shí)，大蒜素對(duì)不同程度增生牙齦間的抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.346），提示高等濃度（9μg/ml）大蒜素對(duì)不同程度增生牙齦的I型膠原分泌的抑制作用相似。

大蒜素抑制成纖維細(xì)胞膠原分泌的具體機(jī)制目前尚不清楚。TGF-β1是重要的致纖維化細(xì)胞因子之一［8］，是不同因素所致組織纖維化的共同通路，如TGF-β1/Smades信號(hào)通路在纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用［9］。有研究表明TGF-β1對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞有較顯著的募集及促增殖作用，并刺激其合成膠原，促使膠原堆積，同時(shí)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶分泌，從而抑制膠原降解［10-12］。由此可見，TGF-β1在成纖維細(xì)胞的趨化和增殖、膠原的合成和降解等過(guò)程中可能起到重要的調(diào)控作用。而有學(xué)者指出大蒜提取物可降低肝臟纖維化大鼠血清中TGF-β1水平［13］。本資料在測(cè)定各標(biāo)本I型膠原的同時(shí)，也測(cè)定TGF-β1的含量。結(jié)果表明，不同濃度大蒜素對(duì)不同程度患者增生牙齦成纖維細(xì)胞的TGF-β1的分泌也有抑制作用，因此抑制效應(yīng)的變化趨勢(shì)與I型膠原的變化趨勢(shì)具有相關(guān)性。GO=1時(shí)I型膠原與TGF-β1的相關(guān)系數(shù)r=0.561（P=0.004），GO=2 時(shí) r=0.823（P=0.000），GO=3 時(shí)r=0.877（P=0.000），提示不同濃度大蒜素作用下，增生程度越高的牙齦I型膠原與TGF-β1相關(guān)性越高。以上研究結(jié)果提示TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)通路可能是大蒜素抗纖維化作用的機(jī)制之一，但其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。