孫貝貝, 何 旭, 夏盛瑜

(中國(guó)石油大學(xué)(華東) 計(jì)算機(jī)與通信工程學(xué)院, 青島 266580)

桑黃是一種古老的中藥, 具有很高的藥用價(jià)值, 研究證實(shí), 黃酮是桑黃液體發(fā)酵的二級(jí)代謝產(chǎn)物, 黃酮可以改善人體免疫系統(tǒng), 減少抗癌藥物的副作用, 緩解患者放療或化療的反應(yīng)[1]. 如今對(duì)黃酮的生產(chǎn)有很大的要求, 但天然的桑黃很少見, 由于缺乏相關(guān)的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)以及桑黃生長(zhǎng)周期較長(zhǎng), 桑黃人工培養(yǎng)難以實(shí)施.2008年, NK Zeng等人通過原生質(zhì)體融合引入了桑黃的育種方法[2]. 發(fā)酵通常用于產(chǎn)生真菌的次級(jí)代謝物,如海藻內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物[3]. 應(yīng)注意, 不同的發(fā)酵方法可以產(chǎn)生具有不同生物活性的次級(jí)代謝物, 目前,黃酮主要是通過桑黃的液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得.

為了提高黃酮的產(chǎn)量, 需要仔細(xì)考慮桑黃液體發(fā)酵培的養(yǎng)條件, 如發(fā)酵溫度, PH 值, 離心機(jī)轉(zhuǎn)速, 接種量和種子年齡. 同時(shí)也應(yīng)考慮培養(yǎng)基的組成, 發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的多個(gè)變量使得生物實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化成為一個(gè)難題. 朱虎等人將發(fā)酵溫度, 接種量, 離心機(jī)轉(zhuǎn)速和裝瓶能力作為自變量, 發(fā)酵產(chǎn)量作為因變量[4], 采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法獲得了桑黃發(fā)酵過程的模型,得到以下最佳發(fā)酵條件: 裝瓶量為120 mL, 接種量為17 mL, 溫度為 26℃, 離心機(jī)轉(zhuǎn)速為 135 r/min. 此時(shí)發(fā)酵菌絲體生產(chǎn)的理論極值為24.51 mg/mL. 其他研究重點(diǎn)是發(fā)酵底物的數(shù)量, 如碳源和氮源的用量. 2010年,朱虎等人使用響應(yīng)面方法, 發(fā)現(xiàn)最佳液體發(fā)酵條件如下: 玉米淀粉濃度為 0.5%, 酵母提取物濃度為 2%, 維生素 B1濃度為 0.1%, 發(fā)酵時(shí)間為6天, 菌絲體 (干重)的產(chǎn)量為 18.43 g/L[5,6]. 應(yīng)該注意的是, 這些研究是基于單因素實(shí)驗(yàn), 結(jié)果依賴于一些自己確定的經(jīng)驗(yàn)參數(shù). 另外, 一些機(jī)器學(xué)習(xí)的策略[7,8]已被應(yīng)用于解決多個(gè)變量的優(yōu)化問題, 而且對(duì)生物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)量要求不高[9,10].

在本文的工作中, 我們專注于發(fā)酵條件中底物濃度的優(yōu)化, 其中包括葡萄糖, 麥芽糖, 甘露醇, 玉米粉,酵母提取物, 硫酸銅, 氯化鈉, 硫酸亞鐵和維生素 B1這九種底物的濃度. 本文通過將粒子群算法(PSO)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)算法相結(jié)合得到一個(gè)智能混合模型, 該模型具有智能學(xué)習(xí)能力, 可以克服大規(guī)模生物實(shí)驗(yàn)的局限性. 通過模擬, 獲得了桑黃液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件, 黃酮的產(chǎn)量增加至 1896.4 μg/mL.

1 桑黃液體發(fā)酵環(huán)境模型改進(jìn)

目前, 針對(duì)桑黃液體發(fā)酵底物濃度優(yōu)化的方法主要有兩種: 正交實(shí)驗(yàn)法和響應(yīng)面法.

正交實(shí)驗(yàn)法就是利用排列整齊的表-正交表來對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行整體設(shè)計(jì)、綜合比較、統(tǒng)計(jì)分析, 實(shí)現(xiàn)通過少數(shù)的實(shí)驗(yàn)次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件, 以達(dá)到最高生產(chǎn)工藝效果[11,12], 這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)法是從大量的試驗(yàn)點(diǎn)中挑選適量的具有代表性的點(diǎn), 利用已經(jīng)造好的表格-正交表來安排實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的方法. 正交實(shí)驗(yàn)法需要進(jìn)行大量的單因素實(shí)驗(yàn), 即只改變一種因素變量值, 其他因素的變量值保持不變, 找出每個(gè)因素中最佳的取值, 遍歷所有的因素, 將每個(gè)因素最好的取值進(jìn)行組合, 通過實(shí)驗(yàn)找出最佳的培養(yǎng)條件[13,14]. 正交實(shí)驗(yàn)法的操作步驟決定了它本身存在了局限性, 一方面, 生物實(shí)驗(yàn)是非常復(fù)雜和耗費(fèi)時(shí)間的, 正交實(shí)驗(yàn)法需要進(jìn)行大量的單因素實(shí)驗(yàn)作為支撐, 而進(jìn)行的單因素實(shí)驗(yàn)也無法囊括所有可能的實(shí)驗(yàn)取值, 另一方面, 本方法缺少具體的模型, 只能通過條件的組合與真實(shí)的實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)的培養(yǎng)方案, 這存在巨大的風(fēng)險(xiǎn)性, 因?yàn)椴煌囊蛩刂g是相互影響的, 兩個(gè)較好的因素值組合真實(shí)情況下可能會(huì)相互影響導(dǎo)致產(chǎn)量下降, 而正交實(shí)驗(yàn)法忽略了這個(gè)方面的影響.

響應(yīng)面分析法, 即響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法(Response Surface Methodology, RSM), 是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù), 采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系, 通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù), 解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[15–17]. 響應(yīng)面分析法相比于正交實(shí)驗(yàn)法, 多了一個(gè)多元二次回歸方程建模的步驟, 建模最常用和最有效的方法之一就是多元線性回歸方法, 對(duì)于非線性體系可作適當(dāng)處理化為線性形式. 在這里, 響應(yīng)面分析法將指標(biāo)與因素之間的關(guān)系默認(rèn)為是線性關(guān)系, 通過建立多元回歸方程結(jié)合數(shù)學(xué)方法求解最大(或最小)值后默認(rèn)為最優(yōu)值, 這忽略了指標(biāo)與因素之間的實(shí)際關(guān)系[18,19], 所建立的模型很難符合真實(shí)的關(guān)系, 這導(dǎo)致所求解的最優(yōu)值缺乏足夠的理論支撐, 因?yàn)檫@個(gè)求值本身就建立在一個(gè)無法符合真實(shí)狀況的模型之上.

1.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建模

Rumelhart[20]提出的反向傳播(BP)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種前置的多路傳播網(wǎng)絡(luò), 具有輸入層, 中間層(隱層)和輸出層三層. 該模型現(xiàn)在是在實(shí)踐中應(yīng)用最廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型之一, 來自輸入層的每個(gè)神經(jīng)元與隱藏層中每個(gè)神經(jīng)元是連接關(guān)系, 而隱藏層中的每個(gè)神經(jīng)元都與輸出層的神經(jīng)元也是全連接關(guān)系. 同一層中每對(duì)神經(jīng)元之間沒有連接[21]. BP網(wǎng)絡(luò)可用于學(xué)習(xí)和存儲(chǔ)輸入和輸出之間的關(guān)系, 在學(xué)習(xí)過程中, 通過反向傳播算法不斷更新網(wǎng)絡(luò)的權(quán)重和閾值, 以獲得實(shí)際輸出和模型輸出最小的平方誤差和[22]. 當(dāng)一對(duì)學(xué)習(xí)樣本被輸入到網(wǎng)絡(luò)中時(shí), 神經(jīng)元激活函數(shù)被從輸出層調(diào)節(jié)到輸入層, 以實(shí)現(xiàn)在輸出層神經(jīng)元中獲得輸入響應(yīng). 隨著訓(xùn)練數(shù)據(jù)的輸入, 網(wǎng)絡(luò)模型的正確率隨著反饋過程的進(jìn)行不斷提高, 得到一個(gè)最能反映真實(shí)關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)模型.

桑黃的液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)是很復(fù)雜的, 不同的實(shí)驗(yàn)條件可以相互影響, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中各種產(chǎn)物的化學(xué)變化過程在生物領(lǐng)域還沒有一個(gè)清晰的認(rèn)知, 現(xiàn)在生物實(shí)驗(yàn)只能實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵之后發(fā)酵罐中各種底物濃度的測(cè)量, 現(xiàn)在可以將整個(gè)桑黃液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)過程看做是一個(gè)未知的非線性的復(fù)雜模型. BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立和訓(xùn)練并不需要了解桑黃液體發(fā)酵過程的本質(zhì)原理,只需要提供具體的輸入和輸出數(shù)據(jù), 利用反饋調(diào)節(jié)算法得到一個(gè)最貼近訓(xùn)練數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)模型, 模型本身就是復(fù)雜的非線性模型, 所以可以確定BP網(wǎng)絡(luò)模型可以作為黃酮產(chǎn)量的預(yù)測(cè)模型.

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在本文中是擬合發(fā)酵條件和黃酮產(chǎn)量關(guān)系的的數(shù)學(xué)模型, 所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具體如下:

(1) 輸入層有9個(gè)神經(jīng)元, 用于輸入發(fā)酵條件的9 個(gè)相關(guān)因素的值: 葡萄糖, 麥芽糖, 甘露醇, 玉米粉, 酵母, 硫酸銅, 硫酸亞鐵, 氯化鈉和維生素 B1.

(2) 隱藏層具有11個(gè)神經(jīng)元. 隱藏層神經(jīng)元的數(shù)量分別實(shí)驗(yàn)了3到13之間的整數(shù), 最后決定為11, 因?yàn)楫?dāng)隱藏層神經(jīng)元數(shù)為11時(shí), 模型輸出值和實(shí)際值之間的均方誤差最小.

(3) 使用一個(gè)神經(jīng)元的輸出層來輸出黃酮的產(chǎn)量.

輸入和輸出值的范圍通過下面的公式被歸一化到[–1, 1]之間:

其中,xmax是訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中相同類別數(shù)據(jù)中的最大值,xmin是訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中相同類別數(shù)據(jù)中的最小值,x是訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的真實(shí)值,U是歸一化之后網(wǎng)絡(luò)的實(shí)際輸入或輸出值, BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的前向運(yùn)算公式如下:

其中,xi是輸入值,wij是權(quán)值,bj是偏倚,f(x)是激活函數(shù),xj是節(jié)點(diǎn)輸出值.

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如圖1所示.

Levenberg-Marquardt算法和共軛梯度算法是本文中BP網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練算法. 這種訓(xùn)練策略將會(huì)使用目標(biāo)函數(shù)的一階導(dǎo)數(shù)的信息和目標(biāo)函數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)的信息, 其描述如下:

其中是網(wǎng)絡(luò)模型中所有權(quán)值和閾值組成的向量,S(Xk)是由X的每個(gè)分量構(gòu)成的向量空間的搜索方向,αk是在f(Xk+1)上的最小步長(zhǎng).

圖1 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

2 粒子群算法優(yōu)化發(fā)酵條件

粒子群算法可以設(shè)定多組可能的初始值, 通過在一定范圍內(nèi)不斷迭代優(yōu)化, 每一次迭代都可以得到不同的條件組合, 直到得到一個(gè)最大(或最小)的適應(yīng)度函數(shù)值, 同時(shí)輸出相對(duì)應(yīng)的輸入值. 桑黃液體發(fā)酵的環(huán)境優(yōu)化需要嘗試不同的條件組合, 通過實(shí)驗(yàn)確定最好的一組實(shí)驗(yàn)條件, 但是在實(shí)際操作中由于實(shí)驗(yàn)周期和實(shí)驗(yàn)代價(jià)等因素的制約, 是無法窮舉所有的實(shí)驗(yàn)組合條件的, 粒子群算法可以有效的解決這個(gè)問題.

PSO算法屬于進(jìn)化算法的一種, 它從隨機(jī)解出發(fā),通過迭代尋找最優(yōu)解, 并且通過適應(yīng)度來評(píng)價(jià)解的品質(zhì), 通過追隨當(dāng)前搜索到的最優(yōu)值來尋找全局最優(yōu)[23–25]. PSO 算法的計(jì)算與公式如下:

式中,i=1,2,…,m; 學(xué)習(xí)因子c1和c2是非負(fù)常數(shù);r1和r2是介于0–1之間的隨機(jī)數(shù);w為慣性常數(shù);k為迭代次數(shù);xi為第i個(gè)粒子的位置向量,vi為速度向量.

為了尋找最好的發(fā)酵條件, 我們結(jié)合粒子群算法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型設(shè)計(jì)了如算法1.

算法1. BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合粒子群算法1) 編碼初始種群中個(gè)體結(jié)構(gòu); 因?yàn)橛?個(gè)變量作為優(yōu)化條件, 所以確定每個(gè)變量有 9 個(gè)屬性. 編碼葡萄糖, 麥芽糖, 甘露醇, 玉米粉, 酵母,硫酸銅, 氯化鈉, 硫酸亞鐵, 維生素 B1 為 g1, g2, g3, g4, g5, g6, g7, g8,g9, 其中 g1∈[0, 40], g2∈[0, 40], g3∈[0, 40], g4∈[0, 100], g5∈[0,100], g6∈[0, 0.5], g7∈[0, 10], g8∈[0, 0.5], g9∈[0, 0.1], 使用的單位是g/L; 初始化m個(gè)粒子的位置并利用公式(1)將其歸一化, 初始化速度, 設(shè)定學(xué)習(xí)因子, 慣性權(quán)重的最大及最小值, 最大迭代次數(shù)及目標(biāo)誤差值, 并置此時(shí)的迭代次數(shù)為1.2) 計(jì)算目標(biāo)適應(yīng)度值. 對(duì)于每個(gè)粒子, 利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的前向計(jì)算公式, 公式(2)和公式(3)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的實(shí)際輸出作為其適應(yīng)度值, 排序取出最大的適應(yīng)度值fitness_max.3) 粒子位置和速度更新. 利用公式(5)和公式(6)更新每一個(gè)粒子的速度和位置, 并以一定概率重新初始化粒子.4) 檢驗(yàn)是否符合結(jié)束條件. 若當(dāng)前的迭代次數(shù)達(dá)到了預(yù)先設(shè)定的最大次數(shù)(或達(dá)到最小誤差要求), 則停止迭代, 輸出最優(yōu)解, 否則轉(zhuǎn)到2).

在迭代分析中, 迭代次數(shù)分別被設(shè)置為100, 150,200 和 500, 種群規(guī)模為 300, 粒子大小為 9, 葡萄糖, 麥芽糖, 甘露糖醇, 玉米漿粉, 酵母, 氯化鈉, 硫酸亞鐵, 硫酸銅和維生素B1染色體的編碼策略是浮點(diǎn)(實(shí))編碼.底物的濃度范圍如下: 葡萄糖: 0–40 g/L, 麥芽糖: 0–40 g/L, 甘露醇: 0–40 g/L, 玉米漿粉: 0–100 g/L, 酵母:0–100 g/L, 硫酸銅: 0–0.5 g/L, 鈉氯化物: 0–10 g/L, 硫酸亞鐵: 0–0.5 g/L, 維生素 B1: 0–0.1 g/L.

在本文的方法中, 第1.1節(jié)建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型將作為粒子群算法的評(píng)價(jià)函數(shù), 用來評(píng)估個(gè)體的好壞.

3 實(shí)驗(yàn)分析

為了建立訓(xùn)練集, 一共進(jìn)行了5000多組實(shí)驗(yàn): 將桑黃菌株接種在PDA傾斜培養(yǎng)基上, 在28℃的溫度下培養(yǎng) 7 天; 在 500 mL 燒瓶中加入 200 mL PDA 液體培養(yǎng)基, 保持溫度在 28℃, 離心機(jī)速度為 150 rpm, 接種后培養(yǎng) 7 天; 250 mL 搖瓶培養(yǎng), 接種后 7 天, 種子液接種量為 10%, 培養(yǎng)基容量為 100 mL, 溫度為 28℃, 速度為150 rpm. 選取了上述實(shí)驗(yàn)中25組桑黃最佳生產(chǎn)數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集, 在表1中, 我們列舉了10個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

表1 10 組發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的最佳發(fā)酵條件

在建立和訓(xùn)練BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型時(shí), 需要確定隱藏層神經(jīng)元的數(shù)量和迭代次數(shù), 再確定隱藏層節(jié)點(diǎn)數(shù)目時(shí), 分別實(shí)驗(yàn)了3到13之間的整數(shù)結(jié)果如表2所示;在確定迭代次數(shù)時(shí), 選擇 300、800、1000 和 1500, 結(jié)果如表3所示.

觀察表2可知, 隱藏層節(jié)點(diǎn)數(shù)為11時(shí), 預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的均方誤差最小.

觀察表3可知, 迭代次數(shù)為800時(shí), 預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的均方誤差最小.

在利用PSO進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)的時(shí)候需要確定迭代次數(shù), 我們選擇了迭代次數(shù)為100、150、200和500進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn), 結(jié)果如表4所示.

表2 不同隱藏層節(jié)點(diǎn)數(shù)預(yù)測(cè)值均方誤差

表3 不同迭代次數(shù)預(yù)測(cè)值均方誤差

表4 PSO 算法中不同迭代次數(shù)黃酮產(chǎn)量預(yù)測(cè)值 (單位: μg/mL)

觀察表4可知, PSO算法迭代次數(shù)為200時(shí), 黃酮的可能產(chǎn)量值較高。

BP網(wǎng)絡(luò)模型作為黃酮產(chǎn)量的預(yù)測(cè)模型, 通過表2和表3可以確定它能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)黃酮產(chǎn)量,PSO算法生成的粒子作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)前向計(jì)算公式的輸入值, 輸出值即為預(yù)測(cè)的黃酮產(chǎn)量, 輸出值越高則證明輸入值為更好的液體發(fā)酵條件.

三個(gè)參數(shù)用于描述BP網(wǎng)絡(luò)模型的精度和速度, 具體來說, 獲得的目標(biāo)誤差 (MSE)為 0.018 999, 操作時(shí)間為3 s, 迭代次數(shù)為577次. 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的收斂性質(zhì)如圖2所示.

如圖2所示, 很容易發(fā)現(xiàn)總體趨勢(shì)是收斂的,收斂速度較快, 當(dāng)均方誤差接近目標(biāo)值的時(shí)候, 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)收斂會(huì)變緩慢, 最終收斂到最佳狀態(tài)值. 模型的覆蓋范圍如圖3所示, 由于PSO從某些隨機(jī)選擇的個(gè)體開始,為了驗(yàn)證算法的可行性, 我們做了60組實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)正和說明, 在表5中, 列出了10個(gè)桑黃發(fā)酵條件的優(yōu)化值和黃酮的產(chǎn)量值, 其中, 達(dá)到最高產(chǎn)量時(shí)葡萄糖的濃度為 40 g/mL; 麥芽糖的濃度為 16.23 g/mL; 甘露醇的濃度為 15.9 g/mL; 玉米漿粉的濃度為 9.25 g/mL; 酵母的濃度為 9.63 g/mL; 硫酸銅的濃度為 0.5 g/mL; 氯化鈉的濃度為 6.21 g/mL; 硫酸亞鐵的濃度為 0.5 g/mL; 維生素B1的濃度為0.1 g/mL.

圖2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的收斂性

圖3 模型的覆蓋范圍

桑黃的平均產(chǎn)量為1866.97 μg/mL, 我們的方法具有智能學(xué)習(xí)能力(BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)), 可以克服生物實(shí)驗(yàn)無法大規(guī)模進(jìn)行的限制. 通過模擬仿真, 獲得了最優(yōu)的培養(yǎng)條件, 黃酮的產(chǎn)量從已知的 1532.83 μg/mL[6]最好增加到 1896.4 μg/mL.

表5 10組優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件以及黃酮產(chǎn)量

4 結(jié)論與展望

在本文的工作中, 我們致力于優(yōu)化桑黃液體發(fā)酵的底物濃度, 包括葡萄糖, 麥芽糖, 甘露糖醇, 玉米粉,酵母提取物, 硫酸銅, 氯化鈉, 硫酸亞鐵和維生素 B1的濃度. 針對(duì)這個(gè)問題, 我們提出了一種結(jié)合粒子群算法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的混合算法, 其中, 由25組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)訓(xùn)練所得的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為混合算法的適應(yīng)度函數(shù), 用于衡量黃酮的產(chǎn)量. 仿真結(jié)果表明, 我們的方法有能力克服限制大規(guī)模生物實(shí)驗(yàn)的局限性, 通過仿真實(shí)驗(yàn), 我們獲得了最優(yōu)的桑黃液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)環(huán)境, 黃酮的產(chǎn)量提高至1896.4 μg/mL.

在我們的研究中, 使用了一種經(jīng)典神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算模型, BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型. 另外, 我們是否可以引入其他的智能模型, 比如支持向量機(jī)作為新的訓(xùn)練模型; 關(guān)于優(yōu)化算法, 我們可以考慮加入并行的運(yùn)算方法, 相信能夠有效的提高效率和準(zhǔn)確率.