徐迪

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

徐冰彥

(合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

金日生

合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009;中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇 南京 210042

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)為山茶科山茶屬小喬木[1]，是中國(guó)特有木本原料，分布較廣[2]。其種子可榨茶油供食用，油茶籽餅粕是榨油副產(chǎn)物[3]，主要含有茶多糖20%～40%[4]。油茶籽餅粕多糖具有降血糖等多方面的生物活性作用[5～7]。本研究從油茶籽餅粕中分離純化其多糖并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，以期為油茶籽餅粕開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

油茶籽餅粕粗多糖：自制；DEAE-52：沃特曼公司；牛血清白蛋白BSA：青島仁和興公司；考馬斯亮藍(lán)：國(guó)藥試劑公司；其余試劑均為分析純，國(guó)藥試劑公司。

十萬(wàn)分之一天平：SARTORIUS公司；ELGA超純水機(jī)：Veolia Water Syestem公司；BT-200恒流泵：上海琪特分析儀器公司；透析袋 MWCO 3.5 kDa：北京索萊寶公司；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器公司；Nicolet-6700傅立葉變換紅外光譜儀：美國(guó)熱電公司；Agilent1200高效液相色譜儀：安捷倫公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清血蛋白為對(duì)照測(cè)定。精密量取上述1mg/mL對(duì)照品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL分別置于10mL試管中，依次添加0.15mol/L NaCl溶液，使終體積為1.0mL，空白對(duì)照為0.15mol/L NaCl溶液1.0mL，分別加5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，震蕩搖勻，室溫下放置10min，紫外595nm處測(cè)定光密度，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取多糖樣品10mg，精密稱(chēng)定，加蒸餾水定容至50mL，吸取1mL至10mL試管中，測(cè)定光密度值，計(jì)算多糖中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 油茶籽餅粕多糖的純化

1) 脫蛋白 多糖樣品溶水溶液加入氯仿-正丁醇(4∶1)，倒入分液漏斗，再加入sevage試劑以5∶1的比例混合，振蕩15min，6000r/min離心10min，收集上層水相，重復(fù)5次。

2) 脫色純化 脫蛋白后的多糖溶液緩慢加入等量10%的雙氧水，30℃水浴48h后，即得脫色后樣品。將200mg多糖樣品溶于1mL水中,DEAE-52纖維素柱層析，水洗脫后，再用0～1.0mol/L NaCl溶液梯度洗脫，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，收集洗脫液，流動(dòng)水透析48h，冷凍干燥，即得。

1.2.3 紫外分析

取50mg多糖，精密稱(chēng)定，定容至10mL，紫外200～400nm范圍內(nèi)測(cè)定。觀察在260nm和280nm處有無(wú)吸收峰判斷是否含有蛋白質(zhì)及核酸。

1.2.4 紅外分析

多糖樣品溴化鉀壓片，在500～4000cm-1處進(jìn)行紅外測(cè)定[8]。

1.2.5 相對(duì)分子量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[9]，采用HPLC法測(cè)定。由葡聚糖凝膠柱Ultrahydrogel TM2000(7.8×300mm Column)和Ultrahydrogel TM500(6×40mm Guard Column)串聯(lián)，ELSD檢測(cè)器；流動(dòng)相為超純水；流速：0.5mL/min；漂移管：90℃；柱溫：35℃；增益：100；氣體壓力：25psi(1psi=6.895kPa)；上樣量：20μL；根據(jù)保留時(shí)間及線性方程計(jì)算相對(duì)分子量。

1.2.6 單糖組成分析

精確稱(chēng)取5mg樣品乙?；髿庀喾治?。不同單糖對(duì)照品對(duì)照。氣相條件：石英毛細(xì)管柱HP-5(30m×0.25mm×0.25μm)；柱溫50→250℃(升溫速度：10℃/min)；離子源：EI，70eV；進(jìn)樣口溫度260℃；相對(duì)分子質(zhì)量范圍：35～650；He流速：1mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖中的蛋白質(zhì)含量

根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=3.351X+0.2627 (R=0.9992)可計(jì)算出多糖中蛋白質(zhì)含量為11.7%，純化后含量降低到1.1%。蛋白質(zhì)脫除率為90.6%。

2.2 脫色純化

由圖1可知，脫色及DEAE-52纖維素柱層析純化可得到多糖組分，即為0.4mol/L NaCl溶液洗脫的組分。

圖1 纖維素DEAE-52柱層析圖

2.3 紫外分析

由圖2可知，紫外光譜分析表明樣品在260nm和280nm處均無(wú)吸收峰，確定純化后多糖中均不含有蛋白質(zhì)和核酸。

2.4 紅外分析

由紅外光譜(圖3)可知3388cm-1吸收峰是糖羥基氫鍵伸縮振動(dòng)顯示的寬峰；2920cm-1吸收峰為C-H伸縮振動(dòng)峰，表明可能存在甲基和亞甲基；1650cm-1處的強(qiáng)吸收帶為羰基的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，1420cm-1處的吸收峰為變形的C-H鍵的振動(dòng)，表明該組分為多聚糖；1100～1010cm-1僅有2個(gè)峰，則可判斷該糖組分含有呋喃糖苷。

2.5 相對(duì)分子量

經(jīng)HPLC檢測(cè)，0.4mol/L NaCl溶液洗脫液為單一對(duì)稱(chēng)峰，保留時(shí)間為14.221min，根據(jù)保留時(shí)間及線性方程計(jì)算出該多糖的分子質(zhì)量為2.0121×107u。HPLC色譜見(jiàn)圖4。

圖2 油茶籽餅粕多糖紫外掃描圖譜圖3 油茶籽餅粕多糖的紅外光譜圖

圖4 油茶籽餅粕多糖高效液相凝膠滲透色譜

2.6 單糖組成分析

GCGC分析表明多糖其主要由鼠李糖、木糖和葡萄糖組成，且摩爾比為11.19∶17.06∶5.81。主要組成為鼠李糖和木糖。結(jié)果見(jiàn)圖5、6。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)單糖的GC圖譜圖6 油茶籽餅粕多糖水解產(chǎn)物的GC圖譜

3 討論

本研究從油茶籽餅粕中提純多糖，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。通過(guò)脫蛋白、脫色、DEAE柱色譜純化、0.4mol/L NaCl洗得多糖，采用高效液相色譜及乙?；瘹庀喾治觥Ｆ浞肿淤|(zhì)量約為2.0121×107 u。IR可見(jiàn)多糖特征吸收峰，UV表明不含蛋白質(zhì)和核酸。主要組成有鼠李糖、木糖和葡萄糖構(gòu)成，摩爾比為11.19∶17.06∶5.81。此研究可為油茶籽餅粕的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。