吳江平

(安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800；蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

張珺，劉超祥

(安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800)

劉艷麗，許瓊明，李笑然，楊世林

(蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)是山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaLinn)植物，油茶皂苷W是從油茶根30%乙醇大孔樹脂洗脫部位中提取分離得到的一種齊墩果烷型皂苷類單體化合物，化學(xué)名稱為22α-O-當(dāng)歸?；?15α,16α,28-三羥基齊墩果-12-烯 3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→4)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷，其分子式為C58H92O26，相對分子質(zhì)量為1204.5877。迄今為止，國內(nèi)外對油茶皂苷單體化合物的藥理活性研究較少。Chen等[1]研究表明，油茶皂苷單體化合物通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯與凋亡來抑制腫瘤細胞MCF-7的增殖。筆者在前期從油茶根中分離出一系列的油茶皂苷單體化合物，體外試驗結(jié)果表明其均具有良好的抗腫瘤活性，對人非小細胞肺癌細胞(簡稱A549細胞)、人乳腺癌細胞(MCF-7)以及人肝癌細胞(SMMC-7721)均具有不同程度的抑制作用且呈現(xiàn)出時間與劑量的依賴關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)油茶皂苷W能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，且能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯于G2/M期[2～4]。為了給開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供科學(xué)依據(jù)，筆者對油茶皂苷W的體內(nèi)外抗腫瘤活性進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

實驗細胞株與A549細胞、H22小鼠肝癌細胞均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。實驗動物ICR小鼠為清潔級，18～22g，雄性，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。油茶皂苷W由蘇州大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室提供，HPLC-ELSD顯示純度>98%；LC-3(兔多克隆抗體，ab51520)、Beclin-1(兔單克隆抗體)購自美國Abcam公司；β-actin(鼠單克隆抗體，3700)購自美國CST公司；羊抗兔多克隆抗體(Lot#111066)、羊抗鼠多克隆抗體(Lot#110692)購自美國KPL公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、小牛血清(NBS)購自美國GIBCOBRL公司；氯喹(CQ)購自美國Sigma公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自美國Biosharp公司；注射用環(huán)磷酰胺(CTX)為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；去甲斑蝥素(Norcantharidin)購自美國Sigma公司；Gimesa染液為南京建成科技有限公司產(chǎn)品；細胞裂解液(RIPA裂解液、PMSF)和Annexim V-FITC/PI染液PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水)為碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品。

BB-15型二氧化碳培養(yǎng)箱：德國Thermo Scientific公司；Thermo MVLTISKANFC型酶標(biāo)儀：德國Thermo Scientific公司；LI-COR型紅外激光成像系統(tǒng)：美國Odssey公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將A549細胞置于含青霉素80萬U/L、鏈霉素100萬U/L、10%小牛血清(NBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25% Trypsin溶液消化細胞進行傳代。取3代以后并處于對數(shù)生長期的細胞進行計數(shù)，然后在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h，待細胞完全貼壁后用于各項實驗。

1.2.2 MTT實驗

收集對數(shù)生長期的A549細胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞懸液濃度至1×105個/mL，每孔加入100μL細胞懸液，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。分別加入終濃度為3、6、9μmol/L的油茶皂苷W，以終濃度為10μmol/L的Norcantharidin溶液處理作為陽性對照組，分別處理12、24、48h。然后于每孔中加入10μL濃度為5mg/mL的MTT溶液并繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄除上清液，在每孔分別加入100μL DMSO溶液后置于搖床上緩慢振搖15min，使結(jié)晶充分溶解，利用酶標(biāo)儀檢測波長為490nm處各孔的光密度值(D)。實驗重復(fù)3次，取其均值計算油茶皂苷W對腫瘤細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率計算公式如下：

細胞增殖抑制率=(1-D1/D2)× 100%

(1)

式中，D1表示給藥組的光密度值，D2表示對照組的光密度值。

1.2.3 細胞形態(tài)實驗

取對數(shù)生長期的A549細胞，用含血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL，混勻后吸取1mL細胞懸液于6孔板中，每組均設(shè)3個復(fù)孔，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h，次日分組給予200μL/孔 終濃度分別為3、6、9μmol/L的油茶皂苷W，對照組加入等體積的PBS緩沖液，孵育24h后，棄去培養(yǎng)基并用PBS洗滌，用Gimesa染液染色5～10min，用自來水沖洗，于室溫晾干后置于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.2.4 MDC自噬熒光強度實驗

取對數(shù)生長期的A549細胞，用含血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL并接種于六孔板中(1mL/孔)，每組均設(shè)3個復(fù)孔，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后,給藥組分別加入終濃度為3、6、9μmol/L的油茶皂苷W，對照組加入等體積PBS，恒溫孵育6h后，收集培養(yǎng)基吸至離心管中，PBS洗滌1次并收集洗滌液，用胰酶消化細胞并收集后在1200r/min的條件下離心3～5min收集細胞。各組細胞分別加入500μL含濃度為50μmol/L MDC的培養(yǎng)基，放在37℃震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，避光孵育60min，用PBS液洗滌并離心2次后再加入PBS重懸，利用流式細胞儀上樣檢測熒光強度。

1.2.5 Western Blot 實驗

收集終濃度分別為3、6、9μmol/L的油茶皂苷W處理24h后的A549細胞，分別加入200μL細胞裂解液，裂解30 min后于冰上進行細胞破碎，然后在4℃、12000r/min的條件下離心15min并取上清，利用改良的福林酚法測定蛋白含量。用12%～15%SDS-PAGE進行電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至NC膜。采用5%脫脂牛奶對膜進行封閉處理，然后在4℃恒溫條件下加入濃度為千分之一的一抗溶液5mL并于搖床中震蕩孵育過夜；次日，采用TBST溶液洗滌一抗溶液3次，每次10min，然后在室溫條件下加入濃度為萬分之一的二抗溶液5mL再孵育2h。利用LI-COR型紅外激光成像系統(tǒng)掃描，對蛋白條帶用Quantity one軟件分析。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染實驗

試驗設(shè)置4個組別，分別是對照組、6μmol/L油茶皂苷W組、CQ組(50μmol/L)和6μmol/L油茶皂苷W+CQ組。取對數(shù)生長期的A549細胞，用含血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，接種于六孔板中，每孔體積為1mL且均設(shè)3個復(fù)孔。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后，CQ組與6μmol/L油茶皂苷W+CQ組預(yù)先加入200μL 濃度為50μmol/L的CQ，其他各組分別加入等體積的PBS，繼續(xù)孵育2h后，中劑量組與6μmol/L油茶皂苷W+CQ組均再加入200μL濃度為6μmol/L的油茶皂苷W，其他各組加入等體積的PBS。繼續(xù)孵育24h后，收集細胞并采用Annexin V-FITC/PI染料染色，利用流式細胞儀上樣分析，統(tǒng)計各組細胞的凋亡率。

1.2.7 小鼠體內(nèi)H22移植瘤模型實驗

1)H22實驗 將凍存于液氮罐里的H22小鼠肝癌細胞取出，放入37℃恒溫水浴中使細胞快速解凍，加入細胞培養(yǎng)液離心收集細胞，用細胞培養(yǎng)液洗滌細胞2次，再用細胞培養(yǎng)液重懸細胞，經(jīng)ICR小鼠腹腔傳細胞3代以上，待細胞在小鼠體內(nèi)生長1周左右后，對腹部出現(xiàn)明顯膨大的小鼠采用頸椎脫臼法處死，用75%醫(yī)酒精消毒腹部并對腹部進行解剖，采用規(guī)格為2mL的一次性無菌注射器抽取小鼠腹腔乳白色腹水，將腹水放入已滅菌的離心管中離心，用0.9%氯化鈉生理鹽水重懸細胞，利用細胞計數(shù)板調(diào)整細胞密度至5×106個/mL，給已適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境的ICR小鼠右腋接種0.2 mL/只細胞懸液進行造模。次日將小鼠按平均體重隨機分為模型組、陽性對照組(CTX 40mg/kg)、油茶皂苷W(1、2mg/kg)組，每組12只，按小鼠體重0.1mL/10g給藥。模型組每天一次腹腔注射0.9%氯化鈉生理鹽水；油茶皂苷W(1、2mg/kg)組每天一次腹腔注射藥物，陽性對照組每2d一次腹腔注射CTX(40mg/kg)，連續(xù)給藥10d，每天稱取小鼠體重。第11天后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，取材、剝離瘤體并稱取瘤重，計算抑瘤率，公式如下：

抑瘤率=(1-W1/W2)×100%

(2)

式中，W1表示給藥組平均瘤重，g;W2表示模型組平均瘤重，g。

2)HE染色實驗 取小鼠腫瘤組織置于pH 7.4、10%福爾馬林磷酸緩沖液中，4℃條件下保存?zhèn)溆?。制備樣品時將將小鼠腫瘤組織包埋在石蠟進行組織切片，用蘇木精和伊紅染色，于光鏡下觀察。

3)腫瘤組織制備與觀察 將腫瘤組織切成體積為1mm3大小后迅速放入預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液中，在4℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｈ∫压潭ǖ哪[瘤組織采用磷酸緩沖液沖洗2遍，每次15min，然后用鋨酸固定1h；1h后用緩沖液沖洗2次，每次15min，接著分別采用30%、50%、70%丙酮梯度脫水15min，然后置于醋酸鈾中過夜。第2天，依次梯度采用80%、90%、100%丙酮脫水15min，置于電鏡包埋劑∶100%丙酮=1∶1混合液中浸潤1h后，再置于純包埋劑浸透2h。將處理好的樣品放入模具或軟囊中進行包埋后放入烘箱聚合，然后將聚合好的樣本嵌入環(huán)氧樹脂中，用玻璃刀切成超薄切片并固定于銅柵格中，用醋酸鈾和檸檬酸鉛混合液進行染色，采用高分辨透射電鏡觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu)變化。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶皂苷W對A549細胞增殖的抑制作用

油茶皂苷W在3～9μmol/L的濃度范圍內(nèi)對A549細胞的增殖有不同程度的抑制作用(圖1)。作用12h后的抑制率分別為(2.13±2.68)%、(20.02±5.32)%和(64.15±7.78)%；作用24h后的抑制率分別為(5.27±2.48)%、(47.63±6.97)%和(78.62±7.85)%；作用48h后的抑制率分別為(8.22±2.57)%、(55.07±5.56)%和(83.66±8.31)%。濃度為10μmol/L的 Norcantharidin各個時間點的抑制率分別為(10.18±2.55)%、(50.23±2.56)%和(68.55±3.63)%，這表明油茶皂苷W具有明顯的抗腫瘤活性。

注：低劑量組、中劑量組、高劑量組油茶皂苷W濃度分別為3、6、9μmol/L,圖2～5同。圖1 不同濃度的油茶皂苷W對A549細胞增殖的抑制作用

2.2 油茶皂苷W對A549細胞生長形態(tài)的影響

不同濃度的油茶皂苷W刺激A549細胞24h后，采用Giemsa染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞的集落與形態(tài)(圖2)。對照組細胞生長狀態(tài)良好，細胞核輪廓清晰，染色質(zhì)明亮，細胞呈不規(guī)則貼壁；隨著油茶皂苷W濃度的提高，細胞數(shù)目明顯減少，細胞出現(xiàn)皺縮變圓，染色質(zhì)濃縮，尤其在油茶皂苷W濃度為6、9μmol/L的時候細胞核出現(xiàn)大量變圓固縮。

圖2 不同濃度的油茶皂苷W對A549細胞生長形態(tài)的影響

2.3 油茶皂苷W對A549細胞自噬的影響

不同濃度的油茶皂苷W作用于A549細胞6h，通過MDC熒光染色并用流式細胞儀檢測熒光強度。結(jié)果顯示，對照組MDC熒光強度為1.36±0.06，3、6、9μmol/L組MDC熒光強度分別為1.46±0.063、1.49±0.067與1.59±0.108(圖3)。與對照組相比，隨著油茶皂苷W濃度的提高，A549細胞自噬的強度依次增強，其中9μmol/L組與對照組相比MDC熒光強度差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。因此，油茶皂苷W能誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生自噬。

圖3 不同濃度的油茶皂苷W對A549細胞自噬影響

圖4 不同濃度的油茶皂苷W對A549細胞中自噬相關(guān)蛋白表達的影響

2.4 油茶皂苷W對A549細胞中自噬相關(guān)蛋白表達的影響

不同濃度的油茶皂苷W作用于A549細胞24h后，能夠明顯上調(diào)Beclin-1蛋白和LC-3蛋白組的表達(圖4)。以β-actin為內(nèi)參照，從數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析可知，Beclin-1蛋白及LC-3蛋白組的灰度值與對照組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 與P<0.01)，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系(圖 5)。

注：*、**分別表示與對照組相比P<0.05和P<0.01。圖 5 自噬相關(guān)蛋白條帶灰度統(tǒng)計分析柱狀圖

圖6 不同濃度油茶皂苷W對A549細胞凋亡影響的流式細胞儀分析圖

2.5 細胞自噬對細胞凋亡的影響

不同濃度的油茶皂苷W對A 549細胞凋亡影響的流式細胞儀分析結(jié)果如圖6所示。對照組與自噬抑制劑(CQ)組的細胞凋亡率分別為(8.60±3.2)%和(2.38±1.3)%；6μmol/L油茶皂苷W組與6μmol/L油茶皂苷W+CQ組細胞的凋亡率分別為(41.88±1.2)%和(19.29±1.5)%。顯示預(yù)先加入自噬抑制劑CQ，腫瘤細胞凋亡率能夠明顯降低，且差異具有十分顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(與對照組相比，P<0.001，圖7)，提示油茶皂苷W誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生自噬，進而促進細胞的凋亡。

2.6 油茶皂苷W對H22荷瘤小鼠的影響

2.6.1油茶皂苷W對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

試驗結(jié)果表明(表1)，油茶皂苷W在1、2mg/kg劑量時，與模型組相比，抑瘤率分別達到25.51%(P<0.05)、54.73%(P<0.01)，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明油茶皂苷W具有良好的體內(nèi)抗腫瘤藥效。

表1 油茶皂苷W對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

注：*、**、***分別表示與對照組比較P<0.05、P<0.01、P<0.001。

注：***表示6μmol/L油茶皂苷W+CQ組與6μmol/L油茶皂苷W組相比差異極顯著(P<0.001)。圖7 腫瘤細胞凋亡率統(tǒng)計分析柱狀圖

2.6.2 油茶皂苷W對H22荷瘤小鼠腫瘤組織病理形態(tài)影響

H22荷瘤小鼠腫瘤組織切片經(jīng)HE染色后在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(圖8)，模型組腫瘤細胞排列緊密、分布密集、呈深褐色，細胞體較大；CTX組腫瘤細胞大量壞死，細胞體積變小，細胞固縮，出現(xiàn)不規(guī)則壞死，出血；油茶皂苷W組在1、2mg/kg劑量時細胞出現(xiàn)一定程度的壞死和細胞體積縮小，且呈現(xiàn)出一定劑量依賴關(guān)系。因此，油茶皂苷W能夠明顯改變H22荷瘤小鼠的腫瘤組織形態(tài)，誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡。

注：A-模型組(100×)；B-環(huán)磷酰胺組(100×)； C-2mg/kg油茶皂苷W組(100×)；D-1mg/kg 油茶皂苷W組(100×)；A′-模型組(400×)；B′-環(huán)磷酰胺組(400×)；C′-2mg/kg 油茶皂苷W組(400×)；D′-1mg/kg 油茶皂苷W組(400×) 圖8 腫瘤組織HE染色病理切片觀察

注：A-模型組； B-環(huán)磷酰胺組；C-2mg/kg 油茶皂苷W組；D-1mg/kg油茶皂苷W 組圖 9 透射電鏡觀察腫瘤細胞超微結(jié)構(gòu)(5000×)

2.6.3油茶皂苷W作用于H22荷瘤小鼠腫瘤組織的超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電鏡觀察腫瘤細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)(圖9)，模型組H22荷瘤小鼠細胞結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，細胞核大，核膜清晰，核仁明顯，染色質(zhì)分散； CTX組腫瘤細胞大部分發(fā)生崩解、染色質(zhì)凝集、核膜碎裂等細胞死亡現(xiàn)象；1mg/kg油茶皂苷W組發(fā)現(xiàn)存在部分細胞核碎裂的現(xiàn)象，2mg/kg油茶皂苷W組存在明顯的細胞核碎裂、邊緣化以及核仁崩解等腫瘤細胞死亡現(xiàn)象，這在腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)上證明了油茶皂苷W具有明顯的體內(nèi)抗腫瘤活性。

3 結(jié)語

體外通過MTT法、Giemsa法檢測不同濃度油茶皂苷W對A549細胞增殖的影響，結(jié)果表明，油茶皂苷W對腫瘤細胞具有良好的生長抑制作用，且呈現(xiàn)出時間與劑量的依賴關(guān)系；MDC自噬熒光實驗和Western Blot實驗表明油茶皂苷W抗腫瘤機制與其誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生自噬有關(guān)，且Annexin-FITC/PI雙染實驗表明通過抑制腫瘤細胞的自噬能夠抑制其凋亡，推測油茶皂苷W可能是通過激活自噬引起細胞凋亡。此外，通過建立體內(nèi)肝癌H22荷瘤小鼠模型，在小鼠腹腔注射不同濃度的油茶皂苷W，通過HE染色，光鏡下觀察到腫瘤組織呈現(xiàn)一定程度的壞死，運用透射電鏡觀察到腫瘤細胞出現(xiàn)了核濃縮、染色質(zhì)邊緣化等凋亡特征，這表明油茶皂苷W亦具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。

細胞的自噬性死亡在人類生理、病理等各種疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用[5～9]。癌癥作為第一大殺手，極大地威脅著人類生命健康[10]。目前，臨床上主要通過手術(shù)切除、化療和放療來治療癌癥，多數(shù)患者會出現(xiàn)免疫力低下等不良反應(yīng)。在采用放療與化療的同時，使用某種輔助藥物來誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生自噬，可以增加腫瘤細胞對放療、化療的敏感性，從而達到徹底根治腫瘤細胞的效果。目前，對細胞自噬與腫瘤的關(guān)系研究已成為抗腫瘤藥物靶點研究的新方向[11～14]。本研究表明，油茶皂苷W能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生自噬，且通過激活自噬的同時能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，這為開發(fā)油茶皂苷類化合物作為新型抗腫瘤藥物提供了依據(jù)。