張丹瑜，張竣，肖云敏，錢衛(wèi)平

（1.汕頭大學醫(yī)學院，廣東　汕頭　515041；2.深圳市人民醫(yī)院計劃生育科，廣東　深圳　518000；3.深圳市人民醫(yī)院龍華分院，廣東　深圳　518000；4.北京大學深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學科，廣東　深圳　518000）

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是婦產(chǎn)科和生殖科常見疾病，是指連續(xù)發(fā)生兩次或兩次以上的自然流產(chǎn)者，病因復雜而多，能識別病因的僅占50%，還有半數(shù)屬于不明原因復發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。對于URSA患者的診斷和治療，臨床上存在較大的爭議，給臨床醫(yī)師及患者帶來很大的困擾。因此，分析URSA的發(fā)生及發(fā)展機制，為研究URSA的發(fā)病及臨床診治提供新的思路和依據(jù)，具有重大的意義。

Ras蛋白是ras基因表達產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)細胞生長及增殖中具有重要影響。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路位于 Ras下游，包括ERK、p38、JNK/SAPK等多個亞家族，其調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡，與人類惡性腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Ras-Raf-MEK-ERK途徑是Ras-MAPK信號通路中最經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導途徑之一，目前研究最為廣泛。近期的研究證實，Ras-MAPK通路可以調(diào)控滋養(yǎng)細胞的侵襲能力，滋養(yǎng)細胞Ras-MAPK通路的異常可能導致復發(fā)性流產(chǎn)[1]。Ras p21蛋白活化子 1（Ras p21 protein activator 1，RASA1）屬于 RasGTPase激活蛋白（GTPaseactivatingprotein，GAP）家族中的一員，具有讓Ras蛋白失活從而抑制Ras信號通路的功能?，F(xiàn)有研究表明，多種腫瘤的發(fā)生，與RASA1表達水平變化密切相關。但其在URSA的發(fā)生、發(fā)展中的作用研究鮮有報道。RASA1作為Ras-MAPK通路的直接調(diào)控蛋白，在滋養(yǎng)細胞中是否對Ras-MAPK通路具有調(diào)控作用，進而影響妊娠結局，現(xiàn)在仍是未知。為了研究RASA1在URSA發(fā)生、發(fā)展過程中的作用,我們采用RT-qPCR研究URSA與健康正常妊娠女性絨毛組織的滋養(yǎng)細胞中RASA1與Ras-MAPK信號通路的mRNA表達水平的差異，并觀察其表達水平與臨床的相關聯(lián)系，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料實驗組：選取2017年8月～2018年2月在本院計劃生育科就診、孕齡49～63 d、B超檢查未發(fā)現(xiàn)原始心管搏動、臨床確診稽留流產(chǎn)、行負壓吸引術終止妊娠的URSA患者20例。對照組：同期同年齡段孕齡49～63 d、既往無任何不良孕產(chǎn)史且至少有一次或以上正常分娩史、本次妊娠無陰道流血等先兆流產(chǎn)癥狀、彩超檢查胚胎發(fā)育正常（有胚芽和心管搏動且大小符合孕周）、要求行負壓吸引術終止妊娠的健康正常妊娠女性20例。

篩選標本標準：研究對象需排除內(nèi)分泌、外科及內(nèi)科系統(tǒng)疾病；無血栓前狀態(tài)；無女性生殖系統(tǒng)畸形及炎癥；夫妻雙方染色體及胚胎染色體無異常；無自身抗體如抗磷脂抗體、抗核抗體、抗DNA抗體、抗精子抗體、抗甲狀腺抗體等；男方精液正常；孕期無劇烈運動、無服用含咖啡因類食品及嗜酒等不良生活習慣及嗜好等。

1.2RT-qPCR法采用RT-qPCR法分別測定URSA與健康正常妊娠女性絨毛組織的滋養(yǎng)細胞中的RASA1與Ras、ERK的mRNA含量。按試劑盒說明書進行操作，以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，RT-qPCR結果通過2-△△Ct法計算兩組目的基因的mRNA相對表達水平，引物序列見表1。

表1　RT-qPCR實驗所用引物序列Table 1　Primer sequences used in RT-qPCR experiment

1.3統(tǒng)計學方法使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用t檢驗比較兩組間的均數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

在URSA患者滋養(yǎng)細胞中RASA1的mRNA含量高于健康正常妊娠女性滋養(yǎng)細胞中RASA1的mRNA含量。在URSA患者滋養(yǎng)細胞中RAS的mRNA含量低于健康正常妊娠女性滋養(yǎng)細胞中RAS的mRNA含量。在URSA患者滋養(yǎng)細胞中ERK的mRNA含量低于健康正常妊娠女性滋養(yǎng)細胞中ERK的mRNA含量，見表2。

表2　URSA患者和健康正常妊娠女性滋養(yǎng)細胞中RASA1、RAS、ERK的mRNA表達水平（x±s）Table 2　mRNAexpression levels of RASA1,RAS and ERK in trophoblast cell of URSApatients and normal pregnant women(x±s)

3　討論

ras基因是一類原癌基因，在生物進化過程中高度保守，其表達的蛋白是Ras蛋白。Ras蛋白位于細胞內(nèi)側(cè)，能與鳥苷酸結合，是膜結合型的GTP/GDP結合蛋白。與GDP結合時處于非活化狀態(tài)；反之，與GTP結合時為活化狀態(tài)，因此Ras的作用可視為分子開關。MAPK屬于細胞內(nèi)廣泛存在的一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以將細胞外刺激向細胞及細胞核內(nèi)傳導。MAPK包括ERK、p38、JNK/SAPK等多個亞家族，在Ras-MAPK信號通路中Ras-Raf-MEK-ERK通路目前研究得最為廣泛。該通路調(diào)控著許多生理活動，如細胞增殖分化及細胞惡性轉(zhuǎn)化等，與腫瘤細胞分化關系密切。近期的研究證實，Ras-MAPK通路可以調(diào)控滋養(yǎng)細胞的生物學功能，與復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生密切相關。Zhu等[2]證實，復發(fā)性流產(chǎn)患者的滋養(yǎng)細胞中Ras-MAPK通路處于失活狀態(tài)，進一步細胞實驗證實，激活Ras-MAPK通路可以顯著促進滋養(yǎng)細胞增殖。Liu等學者發(fā)現(xiàn)[3]，Ras-MAPK通路可以促進滋養(yǎng)細胞進入細胞周期的S期，從而促進滋養(yǎng)細胞增殖。細胞中有兩類信號蛋白調(diào)節(jié)Ras活性，它們分別是Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子（Rasguaninenucleotide exchange factors，Ras GEFs），在Ras GEFs作用下，GDP結合型轉(zhuǎn)化為GTP結合型；另一個是Ras GTP酶活化蛋白（Ras GAPs），其促使GTP向GDP的轉(zhuǎn)化。RASA1位于染色體5q13.1-14.3，在多種生長因子的作用下，可調(diào)控細胞的增殖、遷移和凋亡[4]。RASA1屬胞漿蛋白，相對分子量為120 kD，其C端是GTP酶活化蛋白（GAP）結構域，具有催化作用，N端由PH、CaLB/C2、SH2、SH3等區(qū)域組成。RASA1可激活Ras GTP酶，能水解Ras GTP成Ras GDP而抑制Ras信號通路［5］?，F(xiàn)有的研究表明：RASA1可以通過抑制Ras-MAPK通路進而抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，其與多種腫瘤的發(fā)生密切相關［6-7］。

有關RASA1在URSA中的研究尚淺，本研究通過檢測URSA患者和健康正常妊娠女性絨毛組織滋養(yǎng)細胞中RASA1的mRNA表達水平發(fā)現(xiàn)，RASA1在URSA患者滋養(yǎng)細胞中的表達率顯著高于健康正常妊娠女性滋養(yǎng)細胞中（P＜0.05）；此外，本研究結果顯示，RAS、ERK在URSA患者滋養(yǎng)細胞中表達率顯著低于健康正常妊娠女性（P＜0.05），說明在URSA患者滋養(yǎng)細胞中，RASA1的mRNA升高，可能會導致Ras-MAPK通路的失活，進而讓絨毛組織的滋養(yǎng)細胞增殖能力下降，凋亡增加，侵襲種植能力減弱，最終導致流產(chǎn)。

綜上所述，滋養(yǎng)細胞Ras-MAPK通路的失衡在復發(fā)性流產(chǎn)中起重要作用，而RASA1與Ras-MAPK通路關閉失活密切相關。但是Ras-MAPK通路是如何發(fā)生異常的，其中的調(diào)控機制仍不清楚。本研究證實RASA1在URSA滋養(yǎng)細胞中的表達與健康正常妊娠女性有顯著差異。但本研究僅采用RT-qPCR法檢測了RASA1 mRNA的表達情況，還有很大的不足。將來有關RASA1及Ras-MAPK信號通路在URSA的進一步研究，有望為URSA的臨床診治提供新的方向。