鄭有秀　王　超　鄒曉庭　王　麗　盧建軍*

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江省飼料與動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部(華東)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江大學(xué)動(dòng)物分子營養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095；3.湖北綠雪生物產(chǎn)業(yè)有限公司，咸寧 437110)

斷奶是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的一個(gè)必經(jīng)環(huán)節(jié)。斷奶過程中，仔豬面臨營養(yǎng)、生理、環(huán)境、微生物和免疫應(yīng)激[1]，發(fā)生腸道功能障礙，出現(xiàn)采食量降低和腹瀉等癥狀[2]，小腸絨毛萎縮，影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[3]。研究表明，仔豬飼糧中添加抗生素能在一定程度上緩解斷奶應(yīng)激[4]，但長期使用抗生素會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境、畜禽甚至人類健康造成一定的負(fù)面影響[5-6]。益生菌是近年出現(xiàn)的新型飼料添加劑，能抑制病原菌的黏附和生長繁殖，保持動(dòng)物胃腸道的微生態(tài)平衡，其代謝產(chǎn)生的益生物質(zhì)可作為宿主的營養(yǎng)來源或幫助動(dòng)物消化吸收。由于益生菌具有安全、高效、無污染等優(yōu)點(diǎn)，其已經(jīng)逐步應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品、畜牧和水產(chǎn)等行業(yè)[7]。

丁酸梭菌又名酪酸梭菌，是一種益生菌活菌制劑，為革蘭氏陽性厭氧菌，具有芽孢結(jié)構(gòu)，能夠耐受飼料加工過程中的高溫、高壓環(huán)境[8]，對(duì)人工胃液、腸液和膽鹽也有較強(qiáng)耐受性[9]。丁酸梭菌是人和動(dòng)物腸道中的正常菌群，能產(chǎn)生短鏈脂肪酸、氨基酸、酶等多種益生物質(zhì)，具有促生長和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能，其主要代謝產(chǎn)物——丁酸還可作為腸道上皮組織細(xì)胞再生和修復(fù)的營養(yǎng)物質(zhì)[10]?；诙∷崴缶囊嫔砉δ芎妥鳛轱暳咸砑觿┑目尚行?，其受到研究人員和養(yǎng)殖從業(yè)者的廣泛關(guān)注，并作為一種新型飼料添加劑逐步應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，用以提高畜禽的生產(chǎn)性能，改善機(jī)體腸道環(huán)境，維持腸道結(jié)構(gòu)和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[11-13]。近年來也有丁酸梭菌應(yīng)用于養(yǎng)豬業(yè)的報(bào)道，但其作用效果不一[14-16]，作用機(jī)理尚不明確，需要進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)通過在飼糧中添加不同水平的丁酸梭菌，研究其對(duì)斷奶仔豬生長性能、腸道結(jié)構(gòu)和免疫功能的影響，為丁酸梭菌在生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

丁酸梭菌由湖北綠雪生物產(chǎn)業(yè)有限公司提供，活菌數(shù)為2.0×108CFU/g。

1.2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取(25±1)日齡、體重(6.24±0.32) kg的健康“杜×長×大”雜交仔豬360頭，隨機(jī)分為5個(gè)組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18頭豬。對(duì)照組飼喂不添加丁酸梭菌的玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg丁酸梭菌的試驗(yàn)飼糧?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2012)營養(yǎng)需要，按照嘉豪農(nóng)業(yè)有限公司保育前期料配方配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。各組飼糧均為粉料。試驗(yàn)期30 d。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)14.35粗蛋白質(zhì) CP20.30鈣 Ca0.86總磷 TP0.63有效磷 AP 0.33賴氨酸 Lys1.28蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.83蘇氨酸 Thr0.88

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet: VA 8 000 IU，VB14 mg，VB23.6 mg，VB540 mg，VB64 mg，VB120.02 mg，VD33 000 IU，VE 20 IU，VK32 mg，生物素 biotin 0.15 mg，葉酸 folic acid 1.0 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 11 mg，煙酸 nicotinic acid 10 mg，抗氧化劑 antioxidant 100 mg，Cu (as copper sulfate) 10 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 80 mg，Mn (as manganese sulfate) 30 mg，Zn (as zinc sulfate) 75 mg，I (as potassium iodide) 0.40 mg，Se (as sodium selenite) 0.30 mg。

2)消化能和有效磷為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。DE and AP were calculated values, while the others were measured values.

1.3　飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在浙江省杭州市蕭山區(qū)嘉豪農(nóng)業(yè)有限公司保育舍進(jìn)行，采用漏縫地板保育設(shè)備飼養(yǎng)。試驗(yàn)各組各重復(fù)置于同一保育舍不同保育欄，使不同組別仔豬的飼養(yǎng)環(huán)境差別最小。每天07:00、14:00和21:00喂料，喂料量以料槽中有少量剩余料為宜，全期自由采食與飲水，預(yù)防免疫和飼養(yǎng)管理按常規(guī)方法進(jìn)行。

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天禁食12 h，充足飲水。按照每個(gè)重復(fù)至少隨機(jī)選取1頭的原則，各組隨機(jī)選取6頭仔豬，總計(jì)30頭仔豬，稱量宰前活重后頸動(dòng)脈放血致死，采集血液、分離十二指腸、空腸、回腸、肝臟和脾臟組織。

1.4　檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1生長性能

試驗(yàn)開始和結(jié)束當(dāng)天以重復(fù)為單位，對(duì)試驗(yàn)豬空腹稱重，計(jì)算平均日增重(average daily gain，ADG)；每天記錄各重復(fù)的采食量，計(jì)算平均日采食量(average daily intake，ADFI)和料重比(feed to gain ratio，F(xiàn)/G)；每天觀察各重復(fù)仔豬的腹瀉情況，計(jì)算腹瀉率(diarrhea rate)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)統(tǒng)計(jì)各重復(fù)仔豬的死亡數(shù)，計(jì)算死淘率(mortality)。

F/G=全期飼糧消耗量(kg)/
全期仔豬增重(kg)；
腹瀉率(%)=[試驗(yàn)期內(nèi)腹瀉仔豬頭數(shù)/
(試驗(yàn)仔豬頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))]×100；
死淘率(%)=(試驗(yàn)期內(nèi)死淘仔豬頭數(shù)/
試驗(yàn)仔豬頭數(shù))×100。

1.4.2腸道結(jié)構(gòu)

取十二指腸、空腸、回腸中段約1 cm的腸段，在0.9% NaCl溶液中輕輕漂洗，去除腸道內(nèi)容物后置于4%多聚甲醛中固定48 h以上，經(jīng)過沖水、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，脫水透明，固封。Nikon eclipse 80i共聚焦熒光顯微鏡觀察，NIS-Elements BR 3.2系統(tǒng)拍照、采集并測(cè)量圖片，每個(gè)切片選擇10個(gè)左右相鄰的腸絨毛和隱窩測(cè)量絨毛高度和隱窩深度，計(jì)算絨毛高度/隱窩深度。

1.4.3免疫功能

屠宰后分離出肝臟和脾臟進(jìn)行稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官鮮重(g)/
宰前活重(kg)。

采集血液，靜置，待血清析出后取上清液，3 500 r/min離心15 min，吸取上清液分裝，置于-80 ℃冰箱保存。采用試劑盒測(cè)定血清補(bǔ)體3(C3)、補(bǔ)體4(C4)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量。試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.5　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003進(jìn)行初步整理，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，各組間采用Turkey多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，飼糧添加丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬的ADG和F/G無顯著影響(P>0.05)；250和1 000 mg/kg丁酸梭菌添加組的ADFI顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；250和500 mg/kg丁酸梭菌添加組的腹瀉率較對(duì)照組分別顯著降低了40.99%和44.32%(P<0.05)。由圖1可知，飼糧添加250、500和2 000 mg/kg丁酸梭菌，仔豬的死淘率分別降低了67.11%、49.94%和17.77%，但差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

表2　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，相鄰字母表示差異顯著(P<0.05)，相間字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with the adjacent letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with alternate letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬腸道結(jié)構(gòu)的影響

由表3可知，飼糧添加丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬十二指腸和回腸的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度以及空腸和回腸的隱窩深度均無顯著影響(P>0.05)。丁酸梭菌添加組的空腸絨毛高度較對(duì)照組分別顯著提高了32.23%、35.71%、33.59%和47.36%(P<0.05)，空腸絨毛高度/隱窩深度較對(duì)照組分別顯著或極顯著提高了47.24%(P<0.01)、48.03%(P<0.01)、19.69%(P<0.05)和22.83%(P<0.05)。500 mg/kg丁酸梭菌添加組的十二指腸隱窩深度顯著低于250和2 000 mg/kg丁酸梭菌添加組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖2同。

Value columns with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant differences (P>0.05). The same as Fig.2.

圖1丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬死淘率的影響

Fig.1Effects ofClostridiumbutyricumon mortality of weaned piglets

2.3　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響

所屠宰斷奶仔豬的免疫器官均無異常。由圖2可知，各組斷奶仔豬的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。由表4可知，丁酸梭菌添加組斷奶仔豬的血清IgA含量較對(duì)照組分別顯著提高了112.11%、112.32%、165.55%和139.67%(P<0.05)，血清IgG含量較對(duì)照組分別顯著提高了61.27%、46.43%、59.59%和43.33%(P<0.05)。各組的血清IgM、C3和C4含量無顯著差異(P>0.05)。

3　討　論

3.1　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

丁酸梭菌代謝可產(chǎn)生淀粉酶、維生素和氨基酸等物質(zhì)，促進(jìn)機(jī)體對(duì)脂肪和蛋白質(zhì)的消化吸收[17]。本研究結(jié)果顯示，飼糧添加丁酸梭菌有提高ADG、降低F/G的趨勢(shì)，與龐敏等[15]的研究結(jié)果相一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加丁酸梭菌可顯著提高斷奶仔豬的ADG[14,18]。不同的研究試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是因?yàn)槎∷崴缶漠a(chǎn)品質(zhì)量、添加的劑量和時(shí)間、試驗(yàn)時(shí)間長短和試驗(yàn)動(dòng)物日齡等不同。在本試驗(yàn)條件下，與對(duì)照組相比，250 mg/kg丁酸梭菌添加組仔豬的ADG無顯著變化，ADFI卻顯著降低，F(xiàn)/G降低了12.78%，提示丁酸梭菌能提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高生長性能。與250和500 mg/kg丁酸梭菌添加組相比，1 000和2 000 mg/kg丁酸梭菌添加組斷奶仔豬的生長性能無顯著差異，可能是因?yàn)槎∷崴缶c腸道有益菌競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)物質(zhì)和定植位點(diǎn)，導(dǎo)致可供機(jī)體利用的營養(yǎng)物質(zhì)減少，不利于維持腸道微生態(tài)平衡。

表3　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬腸道結(jié)構(gòu)的影響

圖2　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬免疫器官指數(shù)的影響

表4　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

斷奶仔豬受到營養(yǎng)、心理和環(huán)境等因素的影響產(chǎn)生應(yīng)激，表現(xiàn)出消化不良、腹瀉、生長發(fā)育遲緩、抗病力較弱等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可能死亡[19]。丁酸梭菌可通過刺激黏膜免疫[20]，提高機(jī)體的免疫力和抗病力，拮抗動(dòng)物病原菌，維持和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡[21]，有效緩解仔豬腹瀉。本試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)，飼糧添加丁酸梭菌顯著降低斷奶仔豬的腹瀉率，與肖雪梅等[16]的研究結(jié)果一致。肖克權(quán)等[22]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加丁酸梭菌能改善麻雞的生長性能，降低死淘率，本試驗(yàn)也得出相似的結(jié)論。

3.2　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬腸道結(jié)構(gòu)的影響

斷奶應(yīng)激會(huì)造成腸道損傷，表現(xiàn)為腸道絨毛高度降低，隱窩加深，腸道形態(tài)由濃密、手指狀絨毛群變?yōu)槠交?、舌頭狀絨毛面，小腸主動(dòng)吸收能力降低等[23]。龐敏等[15]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加500 mg/kg丁酸梭菌能顯著降低斷奶仔豬的回腸隱窩深度，提高絨毛高度/隱窩深度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧添加丁酸梭菌能顯著提高斷奶仔豬的空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，可能是因?yàn)槎∷崴缶x產(chǎn)生的丁酸可作為腸道上皮組織細(xì)胞再生和修復(fù)的主要營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)腸道上皮組織的再生和修復(fù)有促進(jìn)作用[6]。丁酸梭菌是人和動(dòng)物腸道的正常菌群，飼糧添加丁酸梭菌還可改善因斷奶引起的腸道菌群失衡，緩解不良環(huán)境對(duì)腸道結(jié)構(gòu)修復(fù)造成的壓力。

3.3　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響

陳振等[24]在斷奶仔豬飼糧中添加復(fù)合益生菌(含丁酸梭菌)，發(fā)現(xiàn)可顯著提高仔豬的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。鄧裴月[25]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧單獨(dú)添加丁酸梭菌或谷氨酰胺對(duì)斷奶仔豬的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均無顯著影響；而當(dāng)丁酸梭菌與谷氨酰胺復(fù)合飼喂時(shí)，仔豬的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)無顯著影響，說明丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬肝臟和脾臟的影響較小或無影響。

免疫球蛋白是介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的主要抗體，能與特異性抗原相結(jié)合引起免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)機(jī)體的作用，其含量的升高提示機(jī)體免疫力提高。王騰浩[26]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加丁酸梭菌ZJU-1具有提高斷奶仔豬血清IgG、IgM和C4含量的趨勢(shì)，可顯著提高血清IgA和C3含量。本試驗(yàn)結(jié)果與該研究結(jié)果相似，與對(duì)照組相比，飼糧添加丁酸梭菌能顯著提高血清IgA和IgG含量。結(jié)果提示，飼糧添加丁酸梭菌可能是通過刺激IgA和IgG的分泌來提高機(jī)體免疫功能。

4　結(jié)　論

① 飼糧添加適宜水平的丁酸梭菌可降低斷奶仔豬的腹瀉率，改善腸道結(jié)構(gòu)。

② 飼糧添加適宜水平的丁酸梭菌可刺激機(jī)體分泌IgA和IgG，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

③ 綜合各項(xiàng)指標(biāo)，25～55日齡斷奶仔豬飼糧丁酸梭菌的添加水平以250～500 mg/kg為宜。