張曉春　陳指龍　方　娟　黎　陳　伍小松　楊　青*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

當(dāng)機(jī)體遭受體內(nèi)外各種有害刺激時(shí)，由于機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，機(jī)體內(nèi)活性氧(ROS)會(huì)大量聚集，使組織細(xì)胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物，從而引起細(xì)胞的氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)氧化損傷可引起動(dòng)物嚴(yán)重的生精障礙，導(dǎo)致睪丸組織發(fā)生明顯的病理變化，睪丸指數(shù)和精子數(shù)下降，精子畸形率升高，造成雄性動(dòng)物不育[1-2]。白藜蘆醇(RES)是一種廣泛存在于葡萄、花生、虎杖、決明、藜蘆等植物性食物中的天然多酚類物質(zhì)，具有很廣泛的生物學(xué)活性，在治療氧化損傷、炎癥、過敏、腫瘤、心血管疾病等方面都得以應(yīng)用[3-4]。目前，RES在畜禽生產(chǎn)中也被廣泛應(yīng)用，它能提高畜禽的生產(chǎn)性能、改善畜禽酮體品質(zhì)和肉品質(zhì)、提高畜禽免疫力和抗氧化能力[5]。高糖高膽固醇飲食可導(dǎo)致小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮合成能力受損，添加RES能夠通過減輕其氧化應(yīng)激，并通過激活沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)及影響下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控發(fā)揮保護(hù)作用[6]。成海建等[7]研究發(fā)現(xiàn)RES可通過激活SIRT1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路促進(jìn)牛皮下脂肪細(xì)胞的凋亡。周曦等[8]研究發(fā)現(xiàn)RES可能通過調(diào)控SIRTl/解偶聯(lián)蛋白2(UCP-2)信號(hào)通路抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。SIRT1具有去乙?；富钚?，通過對(duì)組蛋白、多種轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄共調(diào)控因子的翻譯后修飾(去乙?；?，可調(diào)節(jié)與氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥反應(yīng)相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄[9]。UCP2作為解偶聯(lián)蛋白，能影響線粒體的跨膜電位，當(dāng)線粒體內(nèi)膜電勢(shì)升高時(shí)，UCP2能夠降低細(xì)胞膜內(nèi)外氫離子(H+)濃度，促進(jìn)氧消耗，從而抑制ROS的產(chǎn)生[10]。目前，雖已明確RES的抗氧化作用效果，但對(duì)于其具體的作用機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究以小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3為研究對(duì)象，在過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下研究RES對(duì)氧化損傷細(xì)胞的治療作用，并闡明其可能的作用機(jī)制，以期為防治由氧化損傷引起的雄性生殖系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3細(xì)胞株用DMEM/F12培養(yǎng)基(添加10%的胎牛血清和1%青-鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，使用胰酶消化制備細(xì)胞懸液。

1.2.2iCELLigence細(xì)胞功能分析儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況

將細(xì)胞消化離心后，用含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，制備成密度為2.5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液待用。在E-Plate L8板中加入含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(150 μL/孔)，放入iCELLigence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀(Roche，德國)，在儀器配備的iPad軟件中，選擇增殖試驗(yàn)，用含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基自動(dòng)調(diào)零。隨后取出E-Plate L8板，每孔加入細(xì)胞懸液300 μL，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，待細(xì)胞靜置30 min后將E-Plate L8板重新放置于iCELLigence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀內(nèi)，點(diǎn)擊開始進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。具體操作過程中：1)在確定建立氧化損傷細(xì)胞模型的適宜H2O2濃度的試驗(yàn)中，待細(xì)胞生長(zhǎng)曲線進(jìn)入對(duì)數(shù)期后(即在培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后)，將E-Plate L8取出，輕輕吸出100 μL培養(yǎng)基，再加入100 μL含不同濃度H2O2的培養(yǎng)基，使終濃度分別0(正常對(duì)照組)、150、200、250和300 μmol/L，輕輕混勻后再將E-Plate L8板置于分析儀中，繼續(xù)監(jiān)測(cè)8 h，此過程共監(jiān)測(cè)32 h。2)在確定RES安全濃度的試驗(yàn)中，待細(xì)胞生長(zhǎng)曲線進(jìn)入對(duì)數(shù)期后(即在培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后)，將E-Plate L8取出，分別采用0(正常對(duì)照組)、2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES處理，繼續(xù)監(jiān)測(cè)24 h，此過程共監(jiān)測(cè)48 h。3)在RES干預(yù)處理氧化損傷細(xì)胞的試驗(yàn)中，待細(xì)胞生長(zhǎng)曲線進(jìn)入對(duì)數(shù)期后(即在培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后)，先將細(xì)胞用150 μmol/L的H2O2處理8 h，再分別用0(H2O2組)、2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES處理，同時(shí)設(shè)未經(jīng)H2O2和RES處理的正常對(duì)照組，繼續(xù)監(jiān)測(cè)24 h，此過程共監(jiān)測(cè)56 h。設(shè)置iCELLigence系統(tǒng)每隔15 min實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況，制作增殖曲線，不同曲線可反映不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞實(shí)時(shí)增殖情況，細(xì)胞增殖情況用增殖指數(shù)(proliferation index，PI)表示。在監(jiān)測(cè)結(jié)束時(shí)測(cè)定各個(gè)培養(yǎng)板中細(xì)胞的存活率。

1.2.32′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)探針法檢測(cè)細(xì)胞中ROS含量

待RES(5.0 μmol/L)處理氧化損傷細(xì)胞結(jié)束后，按照ROS檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞中ROS含量，具體操作如下：去掉培養(yǎng)上清液，加入含10 μmol/L DCFH-DA探針的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃孵育細(xì)胞40 min，用胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1次，離心留細(xì)胞沉淀，用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6×105個(gè)/mL，使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度。DCFH-DA本身沒有熒光，當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解為DCFH，而DCFH可被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化為強(qiáng)綠色熒光物質(zhì)DCF，因此，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS的含量成正比，可用熒光強(qiáng)度表示ROS含量。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)檢測(cè)細(xì)胞中SIRT1和UCP2的mRNA相對(duì)表達(dá)量

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

F和R分別代表上游和下游引物。

F and R represent forward and reverse primers, respectively.

1.2.5蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)法檢測(cè)細(xì)胞中SIRT1和UCP2的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量

待RES處理氧化損傷細(xì)胞結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液(含1% PMSF)，吹打均勻，冰上放置30 min，期間劇烈振蕩3次，每次30 s，將細(xì)胞裂解液置于4 ℃，12 000 r/min離心10 min后吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。取適量蛋白質(zhì)樣品用5 Loading Buffer混勻，100 ℃水浴中煮5 min使蛋白質(zhì)變性。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，每孔上樣量為30 μg，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，使用0.2%明膠室溫?fù)u床封閉1 h，分別加入不同的一抗4 ℃孵育過夜；用三羥甲基氨基甲烷吐溫(TBST)洗膜3次，每次10 min；加入相對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；最后用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色，于ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)中檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶并用Quantity One軟件分析條帶的密度值和表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參。

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行方差分析，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　H2O2對(duì)TM3細(xì)胞增殖的影響

不同濃度H2O2處理TM3細(xì)胞8 h后，根據(jù)iCELLigence細(xì)胞功能分析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果(圖1)可知，與正常對(duì)照組相比，各濃度H2O2組的細(xì)胞存活率均極顯著下降(P<0.01)，且呈濃度依賴。其中用150 μmol/L的H2O2處理時(shí)細(xì)胞存活率下降至75%左右，達(dá)到預(yù)計(jì)的損傷效果。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選用150 μmoL/L的H2O2處理細(xì)胞8 h構(gòu)建本試驗(yàn)中所需的氧化損傷細(xì)胞模型。

A：iCELLigence細(xì)胞功能分析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)H2O2對(duì)TM3細(xì)胞增殖的影響。B：不同濃度H2O2處理TM3細(xì)胞8 h后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

A： real-time monitor the effect of H2O2on proliferation of TM3 cells by iCELLigence cell function analyzer. B： effects of different concentrations of H2O2on proliferation of TM3 cells after treated for 8 h.

數(shù)據(jù)柱標(biāo)“**”表示與正常對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

Value columns of each with “**” mean extremely significant difference compared with the normal control group (P<0.01). The same as below.

圖1不同濃度H2O2對(duì)TM3細(xì)胞增殖的影響

Fig.1Effects of different concentrations of H2O2on proliferation of TM3 cells

2.2　RES對(duì)TM3細(xì)胞增殖的影響

為研究RES對(duì)H2O2致TM3細(xì)胞氧化損傷的作用效果，首先檢測(cè)了RES對(duì)TM3細(xì)胞增殖的影響，由圖2可知，用濃度分別為2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES處理正常細(xì)胞24 h后，各濃度RES組與正常對(duì)照組的細(xì)胞存活率無顯著差異(P>0.05)。由圖3可知，當(dāng)用RES處理氧化損傷細(xì)胞24 h后，與H2O2組(僅經(jīng)H2O2單獨(dú)處理，未經(jīng)RES處理的氧化損傷細(xì)胞)相比，各濃度RES組的細(xì)胞存活率均顯著提高(P<0.05)，但仍無法恢復(fù)到正常對(duì)照組水平，且各濃度RES組間無顯著差異(P>0.05)，因此，后續(xù)試驗(yàn)中選取濃度為5 μmol/L的RES對(duì)氧化損傷TM3細(xì)胞進(jìn)行處理。

2.3　RES對(duì)氧化損傷TM3細(xì)胞中ROS含量的影響

由圖4可知，正常細(xì)胞經(jīng)H2O2的處理后，細(xì)胞內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度極顯著增強(qiáng)(P<0.01)，即表明細(xì)胞中ROS含量顯著升高；而氧化損傷細(xì)胞經(jīng)RES處理后，細(xì)胞內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度極顯著下降(P<0.01)，但仍無法恢復(fù)至正常對(duì)照組的水平。這說明RES能夠在一定程度上抑制氧化損傷TM3細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生。

A：iCELLigence細(xì)胞功能分析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RES對(duì)TM3細(xì)胞增殖的影響。B：不同濃度RES處理TM3細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

A： real-time monitor the effects of RES on proliferation of TM3 cells by iCELLigence cell function analyzer. B： effects of different concentrations of RES on proliferation of TM3 cells after treated for 24 h.

圖2不同濃度RES對(duì)TM3細(xì)胞增殖的影響

Fig.2Effects of different concentrations of RES on proliferation of TM3 cells

A：iCELLigence細(xì)胞功能分析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RES對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細(xì)胞增殖的影響。B：RES處理24 h對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細(xì)胞增殖的影響。

A： real-time monitor the effects of RES on proliferation of H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells by iCELLigence cell function analyzer. B： effects of RES on proliferation of H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells after treated for 24 h.

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“#”表示與H2O2組相比差異顯著(P<0.05)。

Value columns with “#” mean significant difference compared with H2O2group (P<0.05).

圖3RES對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細(xì)胞增殖的影響

Fig.3Effects of RES on proliferation of oxidative-damaged TM3 cells induced by H2O2

2.4　RES對(duì)氧化損傷TM3細(xì)胞中SIRT1和UCP2 mRNA和蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖5-A可知，正常細(xì)胞經(jīng)H2O2的處理后，細(xì)胞中SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，UCP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)。而氧化損傷細(xì)胞經(jīng)RES處理后，細(xì)胞中SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)，UCP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。由圖5-B可知，細(xì)胞中SIRT1和UCP2蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與其mRNA相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)一致，即H2O2處理導(dǎo)致SIRT1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，而使UCP2蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量表達(dá)極顯著增加(P<0.01)；RES處理可極顯著提高氧化損傷細(xì)胞中SIRT1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)，顯著降低UCP2蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

3　討　論

3.1　H2O2誘導(dǎo)TM3細(xì)胞氧化損傷模型的建立

目前，在細(xì)胞氧化損傷模型的建立中，多以H2O2作為誘導(dǎo)劑，不同類型的細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)劑的敏感性不一樣，因此誘導(dǎo)劑的濃度和處理時(shí)間非常關(guān)鍵[11-12]。當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度過高或處理時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷太嚴(yán)重，不利于抗氧化機(jī)制的研究；而當(dāng)損傷程度太弱時(shí)，細(xì)胞可能通過自身修復(fù)影響相關(guān)的研究。對(duì)于細(xì)胞氧化損傷模型，一般通過噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)，根據(jù)其吸光度值來判斷細(xì)胞增殖情況從而確定氧化損傷程度，MTT法雖然有其優(yōu)勢(shì)，如重復(fù)性較好、特異性強(qiáng)等，但每次只能確定1個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖情況。本試驗(yàn)中采用iCELLigence細(xì)胞功能分析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可更直觀地判斷細(xì)胞的增殖情況，而且監(jiān)測(cè)過程中不需要特殊試劑，可減少因多次操作所導(dǎo)致的誤差。本試驗(yàn)中，通過iCELLigence細(xì)胞功能分析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)150 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞8 h，細(xì)胞存活率下降至75%左右，符合后續(xù)抗氧化損傷試驗(yàn)的要求，因此確定采用150 μmol/L的H2O2建立細(xì)胞氧化損傷模型。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“##”表示與H2O2組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

Value columns with “##” mean extremely significant difference compared with H2O2group (P<0.01). The same as below.

圖4RES對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細(xì)胞中ROS含量的影響

Fig.4Effects of RES on ROS content in oxidative-damaged TM3 cells induced by H2O2

A：qPCR檢測(cè)RES對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細(xì)胞中SIRT1和UCP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。B：Western-blot法檢測(cè)RES對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細(xì)胞中SIRT1和UCP2蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量的影響。

A：detection of the mRNA relative expression levels ofSIRT1 andUCP2 in H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells with treatment of RES by qPCR. B： detection of the protein relative expression levels of SIRT1 and UCP2 in H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells with treatment of RES by Western-blot method.

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)“**”表示與正常對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，肩標(biāo)“##”表示與H2O2組相比差異極顯著(P<0.01)，肩標(biāo)“##”表示與H2O2組相比差異顯著(P<0.05)。

Values in the same line with “**” superscript means extremely significant difference compared with the normal control group (P<0.01)， with “##” superscript means extremely significant difference compared with the H2O2group (P<0.01)， and with “#” superscript means significant difference compared with the H2O2group (P<0.05).

圖5RES對(duì)H2O2氧化損傷TM3細(xì)胞中SIRT1和UCP2mRNA及蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量的影響

Fig.5Effects of RES on mRNA and protein relative expression levels ofSIRT1 andUCP2 in oxidative-damaged TM3 cells induced by H2O2

3.2　RES對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用

研究表明，動(dòng)物體中90%的ROS源于線粒體電子呼吸傳遞鏈，ROS的產(chǎn)生與線粒體能量代謝緊密相關(guān)，當(dāng)ROS含量增加時(shí)，會(huì)對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)、功能造成損傷，而線粒體受到損傷后又會(huì)促進(jìn)ROS的生成，如此惡性循環(huán)，加重氧化損傷程度[13-14]。解偶聯(lián)蛋白(UCPs)是位于線粒體內(nèi)膜上的一類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們可以介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜的“質(zhì)子漏”使能量以熱的形式散失[15]。UCP2作為UCPs家族成員之一，是UCPs在生殖系統(tǒng)中的主要存在形式[16-17]。大量試驗(yàn)表明，UCP2可以調(diào)控ROS的生成，并參與多種組織的抗氧化損傷作用。Brand[18]提出了UCP2對(duì)ROS的負(fù)調(diào)控假設(shè)模型，當(dāng)ROS含量增加時(shí)，過氧化物在化學(xué)轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的某種物質(zhì)激活UCP2的質(zhì)子漏活性，導(dǎo)致線粒體膜電位的下降，UCP2就以一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)的方式來限制ROS的生成，表明在氧化應(yīng)激過程中，UCP2可以通過降低ROS的生成量保護(hù)機(jī)體免受過氧化損傷。同樣的結(jié)論在Zhang等[19]、王曉娜等[20]的試驗(yàn)中也得到證實(shí)。Zhang等[19]的試驗(yàn)表明，高溫誘導(dǎo)的凋亡能引起小鼠睪丸內(nèi)ROS含量增加，UCP2蛋白質(zhì)表達(dá)量也隨之增加；王曉娜等[20]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，精子內(nèi)UCP2蛋白質(zhì)的表達(dá)量與過氧化氫的作用濃度呈正相關(guān)，UCP2為了對(duì)抗增加的ROS，表達(dá)量也隨之增加。SIRT1作為一種核蛋白，能夠以轉(zhuǎn)錄的形式抑制UCP2的轉(zhuǎn)錄活性，通過與UCP2啟動(dòng)子結(jié)合，抑制UCP2基因的表達(dá)，減少其編碼的線粒體內(nèi)膜蛋白的生成，從而抑制線粒體中解偶聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[21]。相關(guān)研究表明，經(jīng)不同藥物誘導(dǎo)的大鼠或小鼠氧化應(yīng)激模型中，SIRT1都表現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)，而SIRT1一經(jīng)激活，可導(dǎo)致UCP2的表達(dá)下降[8,22-23]。結(jié)合以上信息推測(cè)，在本試驗(yàn)中，RES通過對(duì)SIRT1/UCP2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮對(duì)氧化損傷小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3的保護(hù)作用。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，H2O2組細(xì)胞中ROS含量極顯著增加，SIRT1 mRNA及蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低，而UCP2 mRNA及蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量極顯著升高，提示細(xì)胞被H2O2損傷后細(xì)胞中SIRT1含量的降低可能誘導(dǎo)UCP2含量的增加，以抵抗細(xì)胞中增加的ROS。UCP2生成量增加，解偶聯(lián)線粒體內(nèi)氧化磷酸化過程，減少ATP的生成，ROS的生成量應(yīng)該下降，但氧化應(yīng)激在細(xì)胞中UCP2表達(dá)增強(qiáng)的情況下仍持續(xù)存在，推測(cè)可能是由于UCP2增加的量不足以抵抗ROS的過量產(chǎn)生。相比氧化損傷細(xì)胞，采用RES處理后由H2O2所致的SIRT1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的下調(diào)和UCP2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的上調(diào)均在一定程度上受到抑制，且細(xì)胞中ROS含量也極顯著下降，提示RES作為SIRT1的激活劑，能夠促進(jìn)其表達(dá)。SIRT1被激活后，可抑制UCP2的表達(dá)，理論上應(yīng)該會(huì)產(chǎn)生更多的ROS，但實(shí)際采用RES處理后氧化損傷細(xì)胞中ROS的含量相對(duì)未經(jīng)RES處理的氧化損傷細(xì)胞而言是減少的，分析原因可能是UCP2對(duì)ROS存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，即UCP2表達(dá)被抑制后，細(xì)胞中ROS的含量增加，UCP2通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)的方式限制ROS的產(chǎn)生。

此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)，在正常TM3細(xì)胞中UCP2 mRNA的表達(dá)較豐富，而其蛋白質(zhì)較難檢測(cè)到，而經(jīng)H2O2損傷后TM3細(xì)胞中UCP2蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量極顯著增加。這種情況的出現(xiàn)可能與抗體的特異性有關(guān)；也可能是在生理狀態(tài)下，某些器官中的UCP2 mRNA并不最終表達(dá)為蛋白質(zhì)，而在病理狀態(tài)下就可以啟動(dòng)UCP2 mRNA翻譯為蛋白質(zhì)。在Fisler等[24]的研究中也在胰腺、脾臟、心臟、下丘腦、肺、睪丸、巨噬細(xì)胞等檢測(cè)到大量的UCP2 mRNA，而用Western blot法僅在下丘腦、巨噬細(xì)胞、白色脂肪組織、脾臟、胰島的實(shí)質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到了UCP2蛋白質(zhì)。

4　結(jié)　論

SIRT1/UCP2信號(hào)通路介導(dǎo)了H2O2致TM3細(xì)胞的氧化損傷，RES通過活化SIRT1抑制UCP2表達(dá)，UCP2通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)方式削弱氧化損傷細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，從而在一定程度上抑制TM3細(xì)胞的氧化損傷。