周單華，陳鵬宇，余麗梅

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義　563099； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院司法鑒定中心，貴州 遵義　563099； 3.遵義醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義　563099)

短串聯(lián)重復(fù)系列(short tandem repeat，STR)因其遺傳多態(tài)性高、檢測(cè)靈敏性強(qiáng)、種屬特異性強(qiáng)、可復(fù)合檢測(cè)和自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，已經(jīng)成為了國(guó)內(nèi)外法醫(yī)DNA鑒定應(yīng)用最為廣泛的遺傳標(biāo)記。常染色體STR分析具有符合二倍體遺傳標(biāo)記及孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的特征，是進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別和親子鑒定的常規(guī)分析方法。通常情況下，常染色體STR兩個(gè)等位基因相同時(shí)稱為純合子，在DNA分型圖譜上呈現(xiàn)出一個(gè)峰或一條帶；當(dāng)兩個(gè)等位基因不同時(shí)，稱為雜合子，其分型圖譜表現(xiàn)為兩個(gè)不同的峰或兩條帶。在極少數(shù)情況下會(huì)檢測(cè)到三個(gè)峰或者三條帶，這種情況稱之為三等位基因(tri-alleles)或三帶型。

自STR三等位基因于1999年第一次被 Crouse等[1]人報(bào)道迄今，已經(jīng)在大量的STR上發(fā)現(xiàn)有三等位基因的存在。常染色體STR三等位基因?qū)Ψㄡt(yī)DNA分析中案件的檢測(cè)帶來(lái)一定影響，同時(shí)在某些疾病的輔助診斷分析中有特殊應(yīng)用價(jià)值。

1　三等位基因形成機(jī)制和峰型表現(xiàn)模式

常染色體STR三等位基因是個(gè)體STR分型時(shí)檢測(cè)到的一種異常分型現(xiàn)象，一般認(rèn)為是發(fā)生于染色體異常所致基因數(shù)目異常改變的一種表現(xiàn)。其確切的形成機(jī)制尚不完全明確，國(guó)內(nèi)外主要存有以下幾4種觀點(diǎn)，而其峰型表現(xiàn)模式常見(jiàn)的有兩種。

1.1同源染色體不分離(nondisjunction NDJ)二倍體生物在減數(shù)分裂期形成配子時(shí)，分布于同源染色體上的兩個(gè)等位基因分別隨機(jī)分配到兩個(gè)配子中并遺傳給子代[2]但當(dāng)染色體運(yùn)動(dòng)異時(shí)，常會(huì)導(dǎo)致其不分離[3]。同源染色體間著絲粒DNA含量差異，會(huì)引起姐妹染色單體連接程度和紡錘絲微管的數(shù)量的不同，進(jìn)而導(dǎo)致MⅠ期中二價(jià)體向二極運(yùn)動(dòng)的拉力不均衡和MⅡ期中著絲粒分離時(shí)間的不一致。其可能的機(jī)制是：當(dāng)著絲粒中 DNA及其不對(duì)稱，會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂時(shí)二價(jià)體向兩極運(yùn)動(dòng)的拉力將非常不均衡以及 MⅡ期中同源染色體之間著絲粒分開(kāi)變得不同步，二極體同時(shí)移向某一極，這就直接導(dǎo)致了同源染色體在減數(shù)分裂時(shí)不分離，兩個(gè)等位基因進(jìn)入同一個(gè)配子，與來(lái)自父方或母方的另一個(gè)配子結(jié)合，在此基因座上就形成了三等位基因，最終在DNA分型圖譜上表現(xiàn)出三個(gè)等位基因。

1.2同源染色體不等價(jià)交換同源染色體非姐妹染色單體之間的不等價(jià)交換，使交換后的兩條姐妹染色單體中的其中一條上有一缺失片段，屬于染色體結(jié)構(gòu)缺失；另一姐妹染色單體上添加了相應(yīng)的片段，屬于染色體結(jié)構(gòu)的重復(fù)[4]。兩條同源染色單體之間進(jìn)行不等價(jià)交換后，在一條染色單體上出現(xiàn)了2個(gè)等位基因，這條含有2個(gè)的等位基因的染色單體與另一正常個(gè)體來(lái)源的染色單體組成的子代的基因分型圖譜上會(huì)出現(xiàn)三個(gè)峰，即三等位基因。

1.3嵌合體因?yàn)樽园l(fā)或者人為誘導(dǎo)因素導(dǎo)致人體的遺傳物質(zhì)不僅是來(lái)源于同一個(gè)細(xì)胞體系，而是源于兩個(gè)或兩個(gè)以上個(gè)體的細(xì)胞體系，形成由不同的基因型的細(xì)胞所構(gòu)成的生物體，生物學(xué)上稱之為嵌合體?？梢苑譃閮深悾活悶橥辞逗象w(mosaic)，另一類為異源嵌合體 (chimera)[5,6]。同源嵌合體者的細(xì)胞只來(lái)自于單個(gè)合子，自發(fā)或誘發(fā)導(dǎo)致的基因突變(腫瘤)以及染色體畸變(21-三體綜合癥)均可導(dǎo)致同源嵌合體的產(chǎn)生。同源嵌合體又分為一般性嵌合體(general mosaicism) 和限制性嵌合體(confined mosaicism)。異源嵌合體則是指某一個(gè)體的細(xì)胞來(lái)自二種或其他不同的合子系(Zygotelineage ) ，可分為三種類型：在STR分型上表現(xiàn)為三等位基因的人造異源嵌合體(artificial chimerism)和孿生子異源嵌合體(tiwn chimerism)以及表現(xiàn)為四等位基因的四配子異源嵌合體(tetragametic chimerism)[7,8]。如異基因個(gè)體來(lái)源的干細(xì)胞移植等外源性基因移植后，就可出現(xiàn)多等位基因，也可能是由于在異卵雙胞胎中發(fā)生子宮內(nèi)胚胎間血液交換等，在STR分型圖譜上均可出現(xiàn)為三等位基因形式。

1.4非特異性擴(kuò)增當(dāng)某個(gè)基因座有額外的引物結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，在PCR擴(kuò)增時(shí)，除了擴(kuò)增正常的二等位基因位點(diǎn)，額外的引物結(jié)合位點(diǎn)也同時(shí)擴(kuò)增，導(dǎo)致STR圖譜出現(xiàn)三等位基因。曾有文獻(xiàn)報(bào)道家族六位成員TPOX基因座上出現(xiàn)額外等位基因10，產(chǎn)生三等位基因的原因與其X染色長(zhǎng)體臂某段基因座有潛在的關(guān)聯(lián)[9]。

1.5三等位基因的峰型模式三等位基因由于其形成機(jī)制不同，其峰型模式常見(jiàn)有以下兩種不同表現(xiàn)。一類為三個(gè)等位基因中其中兩個(gè)峰的峰高總和與第三個(gè)峰高接近(見(jiàn)圖1)，另一類為三個(gè)等位基因峰高較為一致[10-11](見(jiàn)圖2)。研究發(fā)現(xiàn)，前一峰型大概由于在減數(shù)分裂期分布于染色體上的某雜合子基因座上發(fā)生了重排，而后一峰型是由于某些體細(xì)胞雜合子基因座產(chǎn)生了突變，其發(fā)生率相對(duì)更高些[10]。

圖1　兩個(gè)峰的峰高總和與第三個(gè)峰高接近

圖2　三個(gè)峰的峰高一致

2　三等位基因?qū)Ψㄡt(yī)鑒定DNA分型結(jié)果的影響

法醫(yī)DNA分型中，個(gè)體常染色體STR三等位基因的檢出增加了案件分析的不確定和復(fù)雜性，為法醫(yī)工作者帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。如單一樣本來(lái)源的不確定性、檢測(cè)方法的可靠性、法醫(yī)學(xué)參數(shù)計(jì)算原理與常規(guī)案件處理的不一致性等。同時(shí)對(duì)不同STR基因座三等位基因發(fā)生規(guī)律的認(rèn)識(shí)，也可為法醫(yī)DNA實(shí)踐提供一定的指導(dǎo)。

2.1存在三等位基因的STR基因座從首次報(bào)道STR三等位基因到目前為止，在 STR Base 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://strbase.nist.gov/tri_tab.htm)收錄了檢測(cè)到 13個(gè)CODIS基因座和14個(gè)非 CODIS基因座上產(chǎn)生三等位基因的情況[12](見(jiàn)表1～2)。

表1CODIS基因座三等位基因模式統(tǒng)計(jì)

基因座例數(shù)染色體位置Gene bank系列號(hào)基序漢族人群中PIC值[13]FGA404q28M64982CTTT0.8479CSF1PO95q33.1X14720TAGA0.6894TH01511p15.5D00269TCAT0.6108TPOX192p25.3M68651GAAT0.5577VWA2612p13.31M25858[TCTG][TCTA]0.7696D3S1358113p21.31AC099539[TCTG][TCTA]0.6691D5S81885q23.2G08446,AC008512AGAT0.7748D7S820227q21.11G08616, AC004848GATA0.7369D8S1179228q24.13G08710[TCTA][TCTG]0.8271D13S3171613q31.1G09017,AL353628.2TATC0.7718D16S5391316q24.1G07925,AC024591.3GATA0.7502D18S514418q21.33X91254,AP001534AGAA0.8459D21S112721q21.1M84567Complex[TCTA][TCTG]0.7948合計(jì)262

由表1中CODIS基因座的結(jié)果可見(jiàn)，重復(fù)序列較長(zhǎng)、基序結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜、具有更高的遺傳多態(tài)性的基因座可以檢測(cè)到更多的三等位基因。如三等位基因次數(shù)最多的基因座依次是D18S51(44次)、FGA(40次)和D21S11(27次)[14]。而遺傳多態(tài)性較差的基因座則不太容易觀察到三等位基因的出現(xiàn)，如D5S818(8次)和TH01(5次)基因座的STR重復(fù)系列AGAT和TCAT就比較簡(jiǎn)單、多態(tài)性程度也低[15-17]。

表2非CODIS-STR基因座三等位基因模式統(tǒng)計(jì)

基因座例數(shù)染色體位置Gene bank系列號(hào)基序漢族人群中的PIC值[13]D2S1338102q35AC010136 ; G08202[TGCC]n[TTCC]n0.8473D19S4331219q12G08036 ; AC008507.6[AAGG][AAAG][AAGG][TAGG][AAGG]n0.7917Penta D1221q22.3AP001752[AAAGA]0.7862Penta E1615q26.2AC027004[AAAGA]0.9114F13A0116P24-P25M21986AAAG-FES/FPS115q25X06292AAAT-F13B11q31-q32M64554AAAT-LPL18p22D83550AAAT-SE3366q14V00481AAAG0.9402D10S1248210q26.3AL391869GGAA0.7095D12S391212p13.2 G08921[AGAT]8-17[AGAC]6-10[AGAT]0-10.8237D22S1045122q12.3 AL022314ATT0.7324D1S165631q42G07820[TAGA]n[TGA]0-1[TAGA]n[TAGG]0-1[TG]50.8093D2S44112p14AC079112TCTA0.7426合計(jì)69

“-”表示暫無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)。

表2中非CODIS基因座觀察到三等位基因次數(shù)最多的基因座依次為：Penta E(16次)、Penta D(12次)、D19S433(12次)和D1S1338( 10次)。同CODIS基因座表現(xiàn)出三等位基因的規(guī)律一致，這幾個(gè)基因座在人群中的遺傳多態(tài)性較高。觀察到三等位基因比較少的基因座則是F13A01、FES/FPS、F13B、LPL、D2S441、D22S1045，都僅有一次報(bào)道。例如D2S1045是ATT的重復(fù)系列，還有一個(gè)原因是這些基因座與CODIS基因座比較起來(lái)，開(kāi)發(fā)利用相對(duì)較晚，所以目前發(fā)現(xiàn)的三等位基因的例數(shù)不多。

2.2三等位基因的判定三等位基因現(xiàn)象在法醫(yī) DNA 日常案件檢測(cè)中比較少見(jiàn)。但如若在實(shí)際工作中檢測(cè)到某個(gè)基因座呈三等位基因，需要對(duì)該基因是否為真實(shí)的三等位基因進(jìn)行確認(rèn)。首先應(yīng)通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)排除模板污染以及操作過(guò)程中人員自身 DNA 污染問(wèn)題；其次還必須針對(duì)同一個(gè)基因座使用引物序列不同的其他擴(kuò)增體系進(jìn)一步驗(yàn)證，不同試劑盒撿測(cè)結(jié)果一致，才可認(rèn)定為三等位基因，得到可靠和準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果[18]。

2.3三等位基因的親權(quán)指數(shù)計(jì)算方式三等位基因的出現(xiàn)涉及到父權(quán)指數(shù)計(jì)算，也涉及到鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和規(guī)范性，目前的計(jì)算方式主要有以下幾種。第1種方法：在親子鑒定和個(gè)體識(shí)別實(shí)踐檢案中，如果子代的三等位基因確定是父親或母親遺傳時(shí)，可將其中的兩個(gè)當(dāng)作為一個(gè)稀有等位基因去計(jì)算親權(quán)指數(shù)值[19]，如果采用遺傳頻率進(jìn)行計(jì)算，可以用兩個(gè)等位基因頻率的乘積估計(jì)在群體中遺傳的頻率。對(duì)于不能確定子代中等位基因親本來(lái)源的，可將其中任意兩個(gè)等位基因頻率相乘后取最小值用以計(jì)算[20]。第2種方法：即按照 Brenner 等采用的方法，根據(jù)母親是否參與親權(quán)鑒定，采用對(duì)應(yīng)的公式進(jìn)行計(jì)算，若子代三等位基因是遺傳過(guò)程中產(chǎn)生的突變，則參照平常親子鑒定案件中突變等位基因處理的方法，將等位基因頻率與平均突變系數(shù)相乘后進(jìn)行親權(quán)指數(shù)的計(jì)算。第3種方法：參照劉芳等人的計(jì)算方式，根據(jù)三聯(lián)體親子鑒定案例中常染色體STR 三等位基因情況的不同，將父權(quán)指數(shù)的計(jì)算公式歸納為5類[21]，其中第一類孩子三等位基因中用成對(duì)遺傳的等位基因 R 和 S不分離(Nondisjunction，NRS)表示，又分為四種亞類。以上3種方法以劉芳等人的計(jì)算方式更為具體化，日常工作中可根據(jù)案件實(shí)際情況選擇合適的計(jì)算公式。

3　三等位基因的臨床應(yīng)用價(jià)值

3.1遺傳性疾病輔助診斷臨床比較常見(jiàn)的三體綜合癥包括以下3種：13-三體綜合征、18-三體綜合征、21-三體綜合征。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道，用分別位于21號(hào)染色體的基因座 PentaD 和 D21S11、18 號(hào)染色體上的基因座 D18S51等分別快速輔助診斷或篩查21-三體綜合癥和18-三體綜合征[22-27]。

此外，同 STR 基因分型用于親子鑒定的原理一樣，可將妊娠期胎兒的絨毛組織和其的母體組織的SRT多態(tài)性進(jìn)行對(duì)比分析，用以鑒別葡萄胎中雙親的遺傳成分，STR 基因分型可以明確區(qū)分一個(gè)雙雌非葡萄胎妊娠三倍體和真正的雙雄PHM 三倍體，也有助于確定如三體或單體病等孤立的染色體異,常以達(dá)到鑒別診斷的目的[28]；STR 圖譜基因分型分析在部分性葡萄胎(partial hydatidiform mole，PHM)與完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole，CHM) 的鑒別診斷中具有重要作用[29]。

3.2異基因干細(xì)胞移植后移植物存活狀態(tài)的判斷利用STR基因座分型技術(shù)對(duì)異基因干細(xì)胞移植的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞在受者的植入、存活情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，已成為異基因細(xì)胞移植術(shù)后常用的植入證據(jù)檢測(cè)手段。因此，除了用于法醫(yī)親子鑒定和個(gè)體識(shí)別的三等位基因檢測(cè)，在血液病救治等臨床療效和不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中具有更為廣闊的應(yīng)用前景，不僅可早期靈敏的判斷移植后造血干細(xì)胞的植活狀態(tài)，而且為研究和探討嵌合體形成、移植排斥以及移植后復(fù)發(fā)提供了一種很好的評(píng)價(jià)方法[30-34]。病人在進(jìn)行了異基因造血干細(xì)胞移植后，當(dāng)移植物存活或形成嵌合體時(shí)，在受者體內(nèi)可檢查到來(lái)自供者細(xì)胞的與受者基因分型不同的等位基因，在圖譜上可表現(xiàn)為三等位基因峰型；移植物成活后，慢性移植物抗宿主病與完全嵌合體的發(fā)生率有高度的一致性。由此推測(cè)，隨著異基因干細(xì)胞治療轉(zhuǎn)化應(yīng)用的逐漸增多，利用STR分型技術(shù)進(jìn)行三等位基因檢測(cè)可能成為干細(xì)胞制劑體內(nèi)分布和代謝動(dòng)力學(xué)研究的較好方法之一。

3.3判斷臍血中的母血污染隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，采取在孕早期絨毛穿刺或孕中期羊水穿刺，使得更多的單基因遺傳病能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)前篩查和確診。目前，單基因遺傳病診斷和胎兒染色體檢查仍采用介入性產(chǎn)前診斷。雖然不同單基因病診斷采取的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)相差較大，但絕大部分依然是通過(guò)采取的胎兒組織，進(jìn)行基因擴(kuò)增后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行STR分型及分析。因?yàn)榛驍U(kuò)增具有高度靈敏的特性，即使混入極微量母體組織也會(huì)影響到基因診斷的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致結(jié)果的誤判。若臍血中存在母血污染，則在某些基因座上會(huì)檢測(cè)到三等位基因(胎兒和母體基因座基因分型為非純合子時(shí))。因此，根據(jù)抽取的胎兒臍帶血細(xì)胞是否檢測(cè)到STR 三等位基因，可以作為判斷母血是否污染臍血有效的檢測(cè)方法[35]，此種檢測(cè)方法具有其他方法不可比擬的靈敏度高、特異性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)捷的優(yōu)勢(shì)。

4　展望

隨著DNA檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，將有越來(lái)越多的三等位基因被發(fā)現(xiàn)報(bào)道。伴隨著三等位基因研究的不斷深入，既有助于進(jìn)一步加深法醫(yī)物證案件中異常DNA分型的理解和應(yīng)用，同時(shí)三等位基因的特殊分型也可以良好地應(yīng)用于臨床特定疾病的篩查、診斷以及療效和預(yù)后的評(píng)估。