牛憲立，魏妮娜，姬可平，謝　奎

(遵義醫(yī)學院 珠海校區(qū)生化教研室，廣東 珠海　519041)

山慈菇IphigeniaindicaKunth為蘭科植物杜娟蘭、獨蒜蘭Rolfe或云南獨蒜蘭P.yunnansisRolfe的干燥假鱗莖。《本草綱目》記載了山慈菇的功效:“主疔腫,攻毒破皮。山慈菇具有清熱解毒、化痰、散結消腫之功,臨床上中醫(yī)常用山慈菇治療疔瘡腫毒、淋巴結核,乳腺增生、食道癌等疾病[1-3]。由于近幾年對山慈菇的有效成分的深入研究,作為藥用的山慈菇得到了廣泛的開發(fā)和利用,使得市場對山慈菇的需求急劇增加,加上藥材的采集比較困難,而且野生數(shù)量也在不斷減少,市場價格就比較高。目前市場上除了正品山慈菇外,還存在大量的偽品和混淆品。常見的有白及Bletillastriata、金果欖Tinosporacapillipe等,它們的根莖在外形上與山慈菇較為相近,但在藥效方面相差甚遠[4-6]。因此,準確地鑒別山慈菇藥材對于保障人們用藥安全意義重大。本研究主要從山慈菇的ITS序列進行測序分析,比較這些易混品在遺傳上的差異,從而為山慈菇的真品鑒定在分子水平上提供更科學的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器供試材料山慈菇S5(1號)及其偽品S1、S2、S3、S4(對應序號2、3、4、5號,S5真品山慈菇,S1、S2、S3、S4分別為園葉金果欖)野外采集于貴州桐梓、鳳崗、湄潭、習水、正安等地。其它偽品及其同源品的ITS序列來源GenBank數(shù)據(jù)庫，形態(tài)學鑒定由廣東省珠海市食品藥品監(jiān)督管理局藥檢所完成。詳細信息見表1。

表1山慈菇及其混偽品材料信息

編號拉丁名中文名科屬來源登錄號1Iphigenia indica Kunth 山慈菇(S5)蘭科、獨蒜屬遵義桐梓KF208461.22Tinospora capillipes園葉金果欖(S1)防己科、青牛膽屬遵義鳳崗KF208385.13Tinospora capillipes圓葉金果欖(S2)防己科、青牛膽屬遵義湄潭KF208386.14Tinospora capillipes圓葉金果欖(S3)防己科、青牛膽屬遵義習水KF208387.15Tinospora capillipes圓葉金果欖(S4)防己科、青牛膽屬遵義正安KF208388.16Pleione grandiflora大花獨蒜蘭蘭科、獨蒜屬GenBank AF461477.17Pleione grandiflora大花獨蒜蘭蘭科、獨蒜屬GenBankAF461476.18Pleione bulbocodiodes獨蒜蘭蘭科、獨蒜屬GenBankEU100770.19Pleione hokerian毛唇獨蒜蘭 蘭科、獨蒜屬GenBankAF461468.110Tinospora sagittata青牛膽防己科、青牛膽屬GenBankFJ980297.111Tinospora sagittata青牛膽防己科、青牛膽屬GenBankJF708200.112Bletilla striata白及蘭科、白及屬GenBankJN388582.1

主要試劑有Tris 、EDTA-Na2.H2O、 CTAB 購于上海生工公司，苯酚、氯仿、異戊醇購于成都科龍化工試劑公司。主要儀器有UV-2550型紫外分光光度計(日本島津公司)、Hema-8000型PCR儀(珠海黑馬儀器廠)、DYC型電泳儀(北京六一儀器廠)、5810R型冷凍高速離心機(Eppendorf)。

1.2實驗方法

1.2.1DNA提取(改良CTAB法)分別稱取5個樣品植物葉片0.2 g,用液氮研成粉末,移入2.0 mL離心管,加入1 mL 65 ℃預熱的CTAB提取緩沖液,充分搖勻,65 ℃水浴60 min,期間混勻3次。然后10 000 rpm離心15 min后取上清液,加入與上清等體積的氯仿:異戊醇(20∶1),加蓋顛倒數(shù)次混勻。于離心機中8 000 rpm離心15 min,取上清轉移至另一新的2.0 mL離心管中，用氯仿∶異戊醇(24∶1)再抽提1次。獲得的上清液加入約2/3體積異丙醇和1/5體積5 mol/L NaAc,加蓋輕混后,8 000 rpm,離心10 min,棄去上清液。用70%乙醇700 μL洗滌沉淀1次,12 000 rpm離心1 min,風干。加100 μL TE液溶解,低溫保存。

1.2.2DNA純度的檢測DNA樣品100倍稀釋后,在紫外分光光度計UV-2550上測定其在260 nm、280 nm處吸光度值,根據(jù)吸光度OD260、OD260/OD280的值計算DNA的濃度和純度。

DNA濃度(μg/mL)=OD260×稀釋倍數(shù)×200

然后在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,檢測 DNA片段長度,觀察并記錄。

1.2.3ITS擴增和測序采用通用引物擴增山慈菇ITS完整序列,引物P1位于18S上(5’-CGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’),引物P2位于26S上(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’),由深圳華大基因科技有限公司合成?；蚪MDNA 1 μL、引物P1和P2各1 μL、dNTPs、 0.2 mmol/L、Pfu DNA聚合酶1.5 μL，加無菌水補充共50 μL反應體系。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min； 94 ℃變性1 min，56 ℃退火2 min，72 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳， 初步鑒定篩選后， 分別送深圳華大基因科技有限公司測序。

1.2.4ITS序列分析將測序的結果進行手工校正,對測序峰圖使用Codon Code Aligner 3.71進行序列拼接，去除引物序列，獲得ITS區(qū)序列。用MEGA 5.0軟件對所有序列分析比對并進行種內、種間遺傳距離的計算; 用NJ(neighbour-2-joiningmethod,NJ)鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結果

2.1DNA的濃度由表2得知,S5(真品山慈菇)、S1、S2、S3、S4(S1～S4分別為貴州不同地方的園葉金果欖)所提取的DNA樣品經過紫外分光光度計濃度檢測:OD260/OD280的比值為1.6～1.8,說明污染比較少,符合做PCR擴增模板。

表2不同來源山慈菇提取的DNA濃度

樣品編號A260A280A260/A280S10.0080.0071.143S20.0340.0211.619S30.0460.0311.484S30.0060.0041.500S40.0840.0651.292S50.0670.0451.489

2.2總DNA電泳圖由圖1可知,提取的植物基因組DNA條帶明亮清晰完整,大小均在15 000 bp左右?？梢杂脕磉M行PCR擴增,獲得其植物rDNA的ITS序列。

M:DNA標準參照物(DL15000); S1～S5:供試材料詳細信息見表1。圖1　基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3PCR擴增ITS序列圖經改良CTAB法提取所有樣品總DNA,PCR擴增ITS序列后，在750 bp處得到預期產物,條帶亮度高且清晰(見圖2)，送深圳華大基因科技有限公司測序。

M:DNA標準參照物(DL2000); S1～S5:供試材料詳細信息見表1。圖2　ITS序列擴增產物電泳圖

2.4測序結果及序列分析

2.4.1山慈菇及習用品的完整序列經深圳華大基因科技有限公司測序得到山慈菇S5與習用品園葉金果欖的S1的ITS序列,將ITS序列通過 CodonCode Aligner軟件進行拼接和校對。

2.4.2ITS序列拼接及分析把測序后的序列利用CodonCode Aligner進行對比校對,山慈菇與園葉金果欖的ITS片段長度差89個堿基,CG含量差0.40%; 山慈菇與園葉金果欖ITS2片段長度差52個堿基,CG含量差3.30%,詳見表3。

表3各片段的特征

序列特征ITS長度(bp)G+C含量(%)ITS2長度(bp)G+C含量(%)園葉金果欖(S1)39255.919655.6山慈菇(S5)48156.324858.9

2.4.3貴州山慈菇及其混偽品ITS堿基比較由圖3可知,山慈菇與大花獨蒜蘭(序列號AF461477.1)比較有1個突變位點,突變序列為G-T,山慈菇與大花獨蒜蘭(序列號AF461476.1) 比較有4個突變位點,突變序列分別為G-T,A-C,A-C,C-G; 山慈菇與獨蒜蘭比較有2個突變位點,突變序列分別為T-C和G-T;山慈菇與毛唇獨蒜蘭比較有2個突變位點,分別為G-T和A-T。山慈菇與4個金果欖比較有分別208個、206個、205個和206個突變位點,山慈菇與2個青牛膽比較分別有187個和194個突變位點,山慈菇與白及比較有70個突變位點。4個金果欖之間比較有6個突變位點; 2個青牛膽之間比較有30個突變位點,由此可見同種屬之間的變異較少,不同種屬之間的變異較多。

“.”代表與第一行相同的堿基;“-”代表缺失; 數(shù)字表示變異位點。圖3　序列對比及變異位點分析

2.4.4山慈菇及偽品的遺傳距離貴州山慈菇及偽品的ITS序列之間的遺傳距離見表4。由表4可知遺傳距離(K-2P)范圍為0.002～0.404,其中1號至5號之間的遺傳距離很小,6號至11號之間的遺傳距離很小,10號于11號之間的遺傳距離也很小。1號與6號、1號與10、1號與12號之間遺傳距離都較大,由他們的距離可以看出真品與偽品之間的遺傳距離較大。

表4山慈菇及偽品的遺傳距離

1Iphigenia indica Kunth2Tinospora capillipes0.0023Tinospora capillipes0.0070.0054Tinospora capillipes0.0040.0020.0075Tinospora capillipes0.0050.0040.0090.0056Pleione grandiflora0.4100.4110.4200.4110.4047Pleione grandiflora0.4040.4030.4120.4030.3970.0118Pleione bulbocodiodes0.4040.4030.4120.4030.3970.0110.0019Pleione hokerian0.4040.4030.4120.4030.3970.0110.0010.00110Tinospora sagittata0.4110.4100.4190.4100.4040.0270.0160.0160.01611Tinospora sagittata0.4060.4060.4150.4060.4000.0110.0200.0200.0200.03712Bletilla striata0.1170.1170.1210.1170.1190.4900.4860.4860.4860.4940.485

2.4.5物種間NJ樹鑒定從ITS序列構建的NJ樹圖(見圖4) 可以看出,山慈菇與獨蒜蘭、大花獨蒜蘭、毛唇獨蒜蘭種間親緣關系較近,聚為一支; 白及單獨聚為一支; 不同地域的金果欖與兩種青牛膽聚為一支上,山慈菇與其混偽品白及、金果欖之間差異較為顯著,分別聚到不同的分枝上。

圖4　山慈菇及偽品的NJ樹

3　討論

隨著現(xiàn)代分子鑒定技術的不斷發(fā)展,對中草藥的品系評價研究已從傳統(tǒng)的形態(tài)性狀、組織解剖、理化特性等方面深入到了分子水平。以DNA指紋技術、DNA測序技術為代表的DNA分子標記技術已廣泛應用于中藥材的品質鑒定中,尤其是rDNA內轉錄間隔區(qū)(rDNA ITS)測序分析技術的發(fā)展。Lau等[7]分析了16種石斛屬植物的rDNA序列,在ITS2區(qū)種間差異為12.4%,而與非蘭科植物和偽品之間的差異分別為29.8%和18.8%,因此,ITS2區(qū)序列完全可以作為鑒定山慈菇藥材的依據(jù)。丁平等[8]將 rDNA-ITS序列分析用于對巴戟天及其常見混偽品的鑒定。rDNA-ITS序列分析技術因不受藥材的生長、環(huán)境、產地等因素的影響,在野生藥材與其栽培品及混淆品的比較研究方面具有更好的應用前景。rDNA ITS序列分析技術還應用于傘房花耳草、白花蛇舌草與纖花耳草、松葉耳草等混雜品的鑒定[9],佛手與其混淆品近緣種香櫞[10],巴戟天及其易混品虎刺、羊角藤[11],以及白木香[12]、高良姜[13]、石斛[14]、紅芪[15]等藥材的鑒定,為藥用植物在野生品、易混品及栽培品等在分子水平的差異提供了重要的參考資料。

由于Rubisco酶大亞基基因編碼序列rDNA ITS序列在不同生物之間存在堿基序列上的差異,因此可廣泛用于物種分類與鑒定、遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育、各親緣關系等方面的研究[16-19]。有關研究表明,rDNA ITS區(qū)序列分析技術在鑒別中藥植物近緣種、易混品及藥材道地性等方面具有方法可靠、靈敏、快捷的優(yōu)點,為進一步確保藥品質量及用藥安全有效等方面發(fā)揮重要作用。

本研究通過對山慈菇ITS序列的比對分析,發(fā)現(xiàn)山慈菇與4個金果欖比較有200多個突變位點,與2個青牛膽比較有180多個突變位點,與白及比較有70個突變位點。而4個金果欖之間只有6個突變位點; 2個青牛膽之間有30個突變位點,由此可見同種屬之間的變異較少,不同種屬之間的變異較多。不同產地的金果欖的ITS序列相似率為99%,且聚在一起。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹圖上進一步分析,白及與山慈菇、獨蒜蘭、大花獨蒜蘭、毛唇獨蒜蘭同為蘭科植物,同聚為一支。但是白芨與山慈菇等在ITS序列有一定的差異,白及單獨聚為一支; 不同地域的金果欖與兩種青牛膽有較近的種間親緣關系,同聚為一支上。由此看出,山慈菇與其混偽品白及、金果欖之間差異較為顯著,分別聚到系統(tǒng)發(fā)育樹不同的分枝上。說明不同產地的山慈菇以及其混偽品有一定的遺傳距離,在種間分化上比較活躍。本研究對貴州道地藥材山慈菇及其偽品rDNA ITS序列進行對比分析,為山慈菇的道地性研究確立初步標準。ITS序列分析技術為建立山慈菇真品鑒定的分子水平標記以及中藥山慈菇DNA條形碼的建立奠定初步基礎。