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(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

骨髓干細胞(Bone marrow stem cells，BMSCs)移植技術(shù)治療肝臟疾病是研究的熱點。BMSCs是一類具有多向分化能力的干細胞，在BMSCs分化過程中受到微環(huán)境及細胞因子的影響，其中肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)作為一種多功能因子，調(diào)控細胞的生長分化及器官的發(fā)育等過程。近期研究表明HGF對BMSCs具有誘導(dǎo)肝向分化作用，本文就HGF對BMSCs肝向誘導(dǎo)分化過程中相關(guān)信號通路進行綜述。

1　骨髓干細胞

細胞分化是同一來源的細胞涉及多種細胞因子及信號通道相互影響而逐漸形成各自特有的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和生化特征的復(fù)雜過程。BMSCs是多向潛能的干細胞，在特定的細胞微環(huán)境中，BMSCs可定向分化。HGF在BMSCs肝向分化過程中占有重要地位，可在一定的條件下，HGF誘導(dǎo)BMSCs向肝細胞分化[1]。因此，HGF作為體外誘導(dǎo)BMSCs向肝細胞方向分化的關(guān)鍵性細胞因子，是肝臟生長發(fā)育過程中最基本的細胞因子。

2　HGF及受體c-Met的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

HGF作為一種多功能因子，參與細胞的增殖，分化，遷移等生物功能。HGF在人體多種細胞中表達，HGF是BMSCs以內(nèi)分泌或旁分泌的形式分泌，由α鏈和β鏈組成，通過生物活性二硫鍵連接的異源二聚體[2]。目前的研究，主要集中在HGF誘導(dǎo)BMSCs肝向分化上。HGF通過與其受體c-Met結(jié)合而起作用。當(dāng)HGF與其受體相結(jié)合，招募銜接蛋白生長因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2，Grb2)和Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白1(grb-2-associated binder 1，Gab1)磷酸化。Grb2和Gab1是與受體直接相互作用的關(guān)鍵效應(yīng)物，和其他銜接蛋白一起為更大的網(wǎng)絡(luò)蛋白裝置提供支架，最終促進多個信號傳導(dǎo)途徑的激活[3]。

HGF特異性受體c-Met蛋白由c-Met原癌基因編碼，是含有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白質(zhì)。配體與受體結(jié)合導(dǎo)致酪氨酸殘基磷酸化，被胞內(nèi)含有src家族同源2結(jié)構(gòu)域(src homology domain2，SH2)的信號分子識別并結(jié)合，從而激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

3　參與HGF誘導(dǎo)BMSCs肝向分化的信號通路

研究發(fā)現(xiàn)，c-Met激活后主要通過有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)通路及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)通路將信號傳至細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)細胞功能[4](圖1)。

3.1有絲分裂原活化蛋白激酶信號通路MAPK信號可被生長因子激活，通過它們的同源酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，TRK)發(fā)出信號。MAPK通路的信號通過由MAPK激酶(MAP kinase kinasekinase，MKKK)、MAPK激酶(MAP kinase kinase，MKK)和MAPK構(gòu)成的三級激酶的依次激活，調(diào)節(jié)細胞的生長、分化等多種重要的細胞生理過程。

圖1　HGF/c-Met信號通路調(diào)節(jié)BMSCs分化的途徑注：當(dāng)HGF與BMSCs上的c-Met受體結(jié)合，促進自磷酸化，激活不同的下游信號傳導(dǎo)途徑。Grb2：生長因子受體結(jié)合蛋白2;Gab1：Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白1；sos：鳥苷核苷酸交換因子；Ras：Ras激酶；Raf：Raf激酶；ERK：細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；PI3k：磷脂酰肌醇3-激酶；PKB：蛋白激酶B(又稱AKT或Rac)； MEK，絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶。PLCγ：磷脂酶 Cγ1；Pkc：蛋白激酶C

MAPK的活性受Ras激酶(rat sarcoma，Ras)/ Raf激酶(rapidly Accelerated Fibrosarcoma，Raf)表達調(diào)控，主要由細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERKs)，c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNKs)和p38MAPKs三部分組成。一般而言，ERK信號通常與有絲分裂刺激激活的細胞存活，增殖和分化有關(guān)，而JNK和p38路徑通常參與細胞生長和凋亡[3]。BMSCs分化可通過激活ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)。T.Lu等[5]證實HGF和其他生長因子通過MAPK通路促進了BMSCs向肝細胞的分化，當(dāng)ERK/MAPK信號通路受到抑制，肝向分化細胞比例顯著降低，進一步證明了ERK/MAPK信號通路參與了BMSCs的肝向分化。

c-Met受體具有酪氨酸激酶活性，與生長因子結(jié)合導(dǎo)致自磷酸化，為含有SH2或磷酸酪氨酸結(jié)合(phosphotyrosine binding，PTB)結(jié)構(gòu)域的蛋白如Grb2提供對接位點。這些銜接蛋白招募更多的效應(yīng)物，如鳥苷酸交換因子(son of sevenless，SOS)。Gab1可以與c-Met結(jié)合被酪氨酸磷酸化，也可間接被Grb2激活。當(dāng)Gab1被受體c-Met直接激活時，Gab1酪氨酸磷酸化持續(xù)時間較長，伴有MAPK及蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB)的活化，從而引起細胞的變形分化。GRB2與SOS結(jié)合，然后被募集到質(zhì)膜。SOS蛋白是一種鳥苷核苷酸交換因子(guanine Nucleotide Exchange Factor，GEF)，可促進Ras蛋白釋放GDP，結(jié)合GTP，導(dǎo)致活性GTP結(jié)合形式的Ras增加。

Ras是一種單一的GTP酶分子。Ras蛋白在活性GTP結(jié)合形式和非活性GDP結(jié)合形式之間循環(huán)。在正常的靜息細胞中，Ras與GDP結(jié)合并處于非活動的狀態(tài)，而在細胞外刺激下，Ras結(jié)合GTP，其具有比GDP更多的磷酸基團，Ras被激活。因此，Ras蛋白在控制細胞增殖、分化等生理活動的信號傳導(dǎo)途徑中起開關(guān)作用。

Raf介導(dǎo)的MAPK途徑是Ras幾個重要的下游級聯(lián)之一。激活的Ras導(dǎo)致Raf途徑的第一個MKKK的活化。Raf磷酸化并激活MAPK激酶(包括MEK1、MEK2)，后者繼續(xù)磷酸化并激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(包括ERK1、ERK2)。ERK1/2是最終的效應(yīng)物，并對大量的下游分子(核和胞質(zhì))發(fā)揮作用。ERK1/2底物包括核成分，轉(zhuǎn)錄因子，膜蛋白和蛋白激酶，進而調(diào)控細胞的生物功能[6]。

信號通路也受到負反饋回路的很大影響。ERK磷酸化并抑制SOS，Raf和MEK1，減少ERK激活。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)方式反應(yīng)了MAPK信號通路在BMSCs分化中的精確平衡。

有研究表明，通過MAPK信號通路還可以進一步影響其他信號通路，如MAPKs在NF-κB信號通路的活化中發(fā)揮重要的作用，可刺激細胞生長，抑制細胞凋亡[7]。當(dāng)阻滯ERK通路時，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子β-鏈蛋白(β-catenin)核定位的減少，從而抑制了Wnt信號通路的信號傳導(dǎo)[8]。

3.2磷脂酰肌醇激酶通路PI3K信號通路在哺乳動物細胞中廣泛存在，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、衰老、生存等細胞功能。P13K屬脂類激酶家族，其中I類P13K是研究最多的，是由催化亞基(p110)和調(diào)節(jié)亞基(p85)組成的異源二聚體,可被酪氨酸激酶活性受體和G蛋白偶聯(lián)受體、Ras基因激活[9]。PI3K招募到細胞膜上，在體外可將PI4-磷酸酯轉(zhuǎn)化成PI3,4二磷酸酯，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)[10]。PIP3與PKB和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將兩個分子都募集到緊鄰的質(zhì)膜上，其中PKB通過PDK1在Tyr-308處的磷酸化被激活[11]。

結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物(tuberous sclerosis complex，TSC)作為Ras同源腦富集蛋白(rashomologenriched in brain，RHEB)的GTP酶活化蛋白，在穩(wěn)定狀態(tài)下可引起RHEB對GTP進行水解，從而將該蛋白從其活性GTP結(jié)合形式轉(zhuǎn)化為其無活性GDP結(jié)合態(tài)。TSC被活化的PKB磷酸化，抑制RHEB活性，從而激活雷帕霉素(the mammalian target of rapamycin，mTOR)。在PI3K途徑活化后，上游激酶PKB也可直接磷酸化TSC2，并使得能夠通過RHEB活化mTOR，從而允許信號傳播[12]。

mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過兩種不同的多蛋白復(fù)合物mTORC1和mTORC2發(fā)揮細胞生物調(diào)節(jié)重要作用。mTORC1是主要的下游效應(yīng)物，控制下游靶標(biāo)蛋白質(zhì)合成。激活的mTORC1通過磷酸化兩種主要的下游分子：翻譯調(diào)控因子真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(e IF4E-binding protein 1，4E-BP1)和核糖體蛋白S6激酶(ribosomal S6 kinase，S6K)，進一步調(diào)控細胞的生物功能[13]。激活的S6K使mTORC2失活，通過負反饋回路抑制PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。而mTORC2通過PKB促進細胞存活，它可直接磷酸化Ser473上的PKB，對PKB的活化起到積極的作用。另一方面，mTORC2可以進一步調(diào)控肌動蛋白細胞骨架和細胞極性的組織，從而決定細胞的形態(tài)。

PI3K-PKB通路還可以影響其它信號通路的傳遞，如通過其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子家族(E-twenty six，ETS)和核因子κB(nuclear Factor-KappaB，NF-κB)參與基因表達和細胞周期的調(diào)控。激活的PKB啟動下游信號事件的級聯(lián)，促進細胞生長，代謝，增殖，存活等生物功能，并間接觸發(fā)級聯(lián)事件，進而激活下游多種效應(yīng)蛋白及通路，這些信號蛋白包括絲氨酸-蘇氨酸激酶(PKB和PDK1)、蛋白酪氨酸激酶( Tec/BTK家族)、GTP結(jié)合蛋白的交換因子(grp1和Rac交換因子)、細胞骨架蛋白和Gab1，影響包括p38 MAPK、NF-κB和JNK/SAPK途徑[11]。

PI3K信號通路被人第10號染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)和Ⅱ型多磷酸肌醇4-磷酸酶(inositol polyphosphate 4-phosphatase type II，INPP4B)精確調(diào)控。PTEN是一種抑癌基因，具有蛋白磷酸酶活性劑脂質(zhì)磷酸酶活性，對細胞周期、多種信號途徑起負性調(diào)控作用。PTEN將PIP3去磷酸化PIP2，下調(diào)PI3K/PKB信號通路，使細胞的生長、增殖等活動受到抑制。INPP4B是一種脂質(zhì)磷酸酶，促進細胞內(nèi)磷酸肌醇的穩(wěn)定，將磷脂酰肌醇3,4-二磷酸去磷酸化為3-磷酸磷脂酰肌醇，使PKB的激活受到抑制，導(dǎo)致PI3K/PKB信號通路被阻斷[14]。提示PTEN通過調(diào)控PI3K信號通路抑制細胞的增殖、分化、凋亡等。

P13K是存在于細胞質(zhì)中的脂類激酶，被HGF激活后，可活化下游關(guān)鍵蛋白PKB，調(diào)節(jié)細胞的多種生物功能。有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs分化過程中有下游蛋白PKB的表達，通過應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002阻斷該通路在BMSCs中的活化，觀察到BMSCs在增殖分化過程中受到了抑制，這主要表現(xiàn)在PKB的表達減少[15]。BMSCs的增殖分化能力明顯下調(diào)，證明了阻斷PI3K通路將抑制細胞的活性。

3.3蛋白激酶C通路HGF/c-Met還可以激活磷脂酶 Cγ1/二脂酰甘油/蛋白激酶C 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(PLCγ1 /DAG/PKC 信號通路)，廣泛存在于多種細胞內(nèi)，參與調(diào)控細胞生長、增殖、分裂等生理活動。在體外實驗中，PKC的持續(xù)激活是一些細胞分化所必須的。PKC信號通路中的下游信號分子如cdc2，cyclinB磷酸化調(diào)節(jié)細胞的分裂和生長。PKC通過Raf-1激活MAPK通路，把信號傳入核內(nèi)。另外，PKC的直接磷酸化底物還包括核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,I-κB)和豆蔻?；槐彼酑激酶底物蛋白(myristoylated alanine-rich C-kinase substrate，MARCKs)。其中I-κB在PKC的磷酸化下解離出有活性的NF-κB，它作為轉(zhuǎn)錄因子，也調(diào)節(jié)著許多早期反應(yīng)基因c-fos，c-jun等的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化等[16]。綜上表明PKC 信號通路在細胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用，促進細胞的生長發(fā)育。

4　誘導(dǎo)分化時細胞的變化

BMSCs肝向分化是一個綜合變化的復(fù)雜過程，隨著細胞信號的傳導(dǎo)，細胞在分化過程中逐漸出現(xiàn)相關(guān)基因的改變及表達的改變，對細胞的代謝、生長等有著密切的影響，并出現(xiàn)肝細胞特有的代謝產(chǎn)物。

4.1基因表達的改變研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs肝向分化過程中有121個基因表達發(fā)生了變化，其中約73%基因上調(diào)，約27%基因下調(diào)。這些基因涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成等[17]。研究進一步指出，血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶(serum and Glucocorticoid Induced Kinase，SGK)基因可以通過HGF被激活，參與調(diào)節(jié)細胞存活，以及細胞-細胞和細胞-基質(zhì)相互作用的信號通路。通過HGF聯(lián)合其他因子誘導(dǎo)BMSCs研究發(fā)現(xiàn)，HGF可促進血清和SGK的上調(diào)，有利于細胞的存活及增殖，為BMSCs肝向分化提供了基礎(chǔ)。姜華等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠骨髓MSCs肝向分化模型中，利用芯片檢測出，F(xiàn)as、G6pc、S100a1、Ndufa7基因表達增加。Fas為內(nèi)源性脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶，參與脂肪代謝。G6pc 為葡萄糖-6-磷酸酶，是糖代謝過程中的關(guān)鍵酶。S100a1 參與大量細胞的周期調(diào)控、分化等過程。Ndufa7是泛醌氧化還原酶，存在于細胞線粒體上，參與線粒體呼吸鏈的調(diào)節(jié)，生成ATP。

4.2特殊蛋白的表達及代謝的改變甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、白蛋白、細胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)、α-1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)，酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(tyrosine aminotransferase，TAT)是肝細胞特異性標(biāo)志物。AFP及白蛋白是肝前體細胞分泌的一種胞漿蛋白，在幼稚的肝前體細胞中表達，是肝細胞未成熟的標(biāo)志，隨著細胞的成熟而消失。CK18是骨架蛋白，和白蛋白一起表達在成熟肝細胞中。有研究發(fā)現(xiàn)，利用HGF等誘導(dǎo)BMSCs肝向分化后，可以檢測到白蛋白和CK-18蛋白的表達，提示BMSCs逐漸分化為成熟肝細胞[18]。

只有肝細胞才能產(chǎn)生、儲存糖原，因此，在骨髓肝細胞分化為肝細胞，可檢測出糖原的存在。Li等[19]對BMSCs進行體外培養(yǎng)，加入HGF等生長因子誘導(dǎo)后，觀察到BMSCs糖原的產(chǎn)生，并進一步檢測到BMSCs產(chǎn)生的AFP、CK18、ALB的表達，提示骨髓間充質(zhì)干細胞在HGF等生長因子誘導(dǎo)下，可向肝樣細胞分化。Al Ghrbawy NM等[20]通過實驗發(fā)現(xiàn)，BMSCs經(jīng)肝細胞分化培養(yǎng)基處理后，出現(xiàn)上皮細胞多邊形的變化，并表達肝相關(guān)基因和蛋白質(zhì)，證明了BMSCs成功分化為肝樣細胞。

HGF/c-Met信號通路具有介導(dǎo)細胞增殖、遷移、分化、凋亡等功能，在BMSCs分化中發(fā)揮重要的作用，其中有PI-3K、MAPK、PKC等信號通路的參與。通過調(diào)控基因表達，BMSCs分化為肝細胞，表達AFP、白蛋白、CK18等肝細胞特異性標(biāo)志物，并產(chǎn)生糖原及尿素。目前人們對HGF涉及的通路認識還不完善，比如HGF與受體c-Met結(jié)合后其大量的生物學(xué)結(jié)點研究較少，各通路相互之間的聯(lián)系，及其它信號通路的激活狀態(tài)等仍有未知。HGF誘導(dǎo)的BMSCs肝向分化，有利于肝臟的組織修復(fù)，隨著BMSCs肝向分化研究的不斷完善，將為肝病的治療提供理論依據(jù)和參考。