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(1.中南大學湘雅藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078；2.心血管研究湖南省重點實驗室)

活化素受體樣激酶1(activin receptor-like kinase 1，ALK1)是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)受體超家族的一種跨膜絲氨酸/蘇氨酸受體激酶。ALK1具有顯著的細胞特異性，主要表達于動脈內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)[1]。ALK1與四個配體相互作用：(1)TGF-β1和TGF-β3，與TGF-β II型受體(TβRII)形成復(fù)合體；(2)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)9和BMP10，與活化素受體IIA型(ActRIIA)或BMPII型受體(BMPRII)形成復(fù)合體。ALK1激活誘導(dǎo)Smad1/5/8磷酸化，Smad1/5/8與同類受體Smad4形成二聚物，此復(fù)合體轉(zhuǎn)移至細胞核并直接調(diào)節(jié)特定基因的轉(zhuǎn)錄[2]。

ALK1編碼基因Acvrl1雜合突變導(dǎo)致2型遺傳性出血性毛細血管擴張癥(hereditary hemorrhagic telangiectasia，HHT2)的發(fā)生，而促進配體結(jié)合的輔助受體內(nèi)皮糖蛋白(endoglin)雜合突變則引起HHT1[3-4]。這兩個基因突變占HHT病例的85%～96%[5]。缺少ALK1信號傳遞會使HHT患者發(fā)展成動靜脈畸形，其特征為動脈和靜脈之間直接發(fā)生聯(lián)系。由于正常的毛細血管起到緩沖動靜脈之間血液流動速度，并與周圍組織進行高效氣體交換的作用，因此動靜脈畸形可導(dǎo)致組織出血和缺氧。ALK1不僅在內(nèi)皮細胞表達，也在平滑肌細胞、成肌纖維細胞、肝星狀細胞、軟骨細胞、單核細胞、成肌細胞、巨噬細胞和成纖維細胞表達，但其在這些細胞中的作用還未得到深入研究[6]，這也說明ALK1與心血管疾病的確存在復(fù)雜的聯(lián)系。本文旨在描述ALK1的信號傳導(dǎo)和對心血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的病理生理作用及相關(guān)機制，從而概述其與心血管疾病的關(guān)系。

1　ALK1蛋白結(jié)構(gòu)與基因調(diào)控

1.1ALK1結(jié)構(gòu)ALK1 是TGFβ/BMP配體超家族的I型受體，結(jié)構(gòu)可分為四大區(qū)域：①信號肽，在形成成熟蛋白質(zhì)的過程中發(fā)生移動；②富含半胱氨酸的EC域，屬于配體結(jié)合區(qū)域；③細胞內(nèi)域，富含甘氨酸/絲氨酸GS域(172-201)和絲氨酸/蘇氨酸激酶域(202-492)，對調(diào)節(jié)激酶活性很重要，可使Smad1/5/8磷酸化；④單獨的跨膜域(圖1)。ALK1與其他I型受體的GS域、絲氨酸-蘇氨酸激酶域和C-端尾部具有高度相似性[7]，但細胞外域卻不同。

圖1　ALK1的分子結(jié)構(gòu)示意圖

1.2ALK1與基因調(diào)控ALK1不與TGF-β直接結(jié)合，而是與TGF-β、TβRII(TGFβ II型受體)形成一個高親和力的異聚受體復(fù)合體[8]。TβRII結(jié)合配體和ALK1后，使ALK1近膜GS域磷酸化，GS域又激活TβRII絲氨酸/蘇氨酸激酶活性[9]。此外，免疫親和素FKBP12[10]和核受體肝X受體β(LXRβ)[11]等蛋白質(zhì)也能結(jié)合ALK1，并下調(diào)其表達。

ALK1下游激活時，其下游靶標pSmad1/5/8以及ID1、ID2、ID3編碼轉(zhuǎn)錄抑制蛋白；Smad6和Smad7編碼抑制型Smads[12-13]。Endoglin也是ALK1的靶標[12-13]。細胞實驗發(fā)現(xiàn)，Notch和ALK1刺激對Notch靶標(由RBPJ/NICD引起的，如HEY1和HEY2)的mRNA表達具有加強或協(xié)同效應(yīng)[14-15],而刺激BMP9會使pSmad1/5/8與這些啟動子結(jié)合[16]。然而，pSmad1/5/8、RBPJ和NICD如何影響這些基因啟動子尚不清楚。BMP9/ALK1下游靶標Notch的誘導(dǎo)是否需要RBPJ或NICD，證據(jù)不一致[14-15,17]。

其他由ALK1調(diào)控的基因包括編碼動脈標記蛋白的趨化因子受體(CXCR4)和在內(nèi)皮細胞表達的促遷移因子DLL4(delta-like 4)，以及編碼內(nèi)皮縮血管肽的內(nèi)皮素-1 (endothelin 1，EDN1)[18]。破壞斑馬魚的ALK1編碼基因Acvrl1或BMP10/BMP10類似物將上調(diào)CXCR4a和DLL4的表達，下調(diào)動脈內(nèi)皮細胞中EDN1的表達[19-20]。在培養(yǎng)的人內(nèi)皮細胞中，BMP9/ALK1信號傳遞會抑制CXCR4而誘導(dǎo)EDN1[21]。然而，無論是EDN1缺失還是Notch激活都足以形成Acvrl1突變擬表型，而無論是CXCR4a缺失還是Notch抑制都能夠挽救Acvrl1突變[19-20]。人內(nèi)皮細胞中，BMP9/ALK1信號傳遞也誘導(dǎo)聯(lián)接蛋白40(CX40，也稱為GJA5)表達，此蛋白能編碼縫隙連接的組成部分，Acvrl1和CX40在基因水平上能影響小鼠受傷引起的皮膚動靜脈畸形發(fā)展[22]。TMEM100編碼功能未知的小跨膜蛋白，在小鼠和培養(yǎng)內(nèi)皮細胞中，BMP9/ALK1誘導(dǎo)其表達[23-24]。TMEM100在胚胎和出生后動物的內(nèi)皮細胞中表達，其大量缺失則能模擬動物Acvrl1在胚胎、新生兒和成年階段的缺失表型[24]。TMEM100由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)，位于細胞膜上[21]，說明它可能通過內(nèi)膜系統(tǒng)與跨膜受體的伴侶作用有關(guān)。

2　ALK1信號傳導(dǎo)

2.1ALK1與TGF-β/BMP9/10人類TGF-β家族包括33個分泌配體，在結(jié)構(gòu)和種系基礎(chǔ)上分為多個亞族，包括TGF-βs、活化素類、Nodal和BMPs。TGF-β家族配體與I型和II型跨膜受體(絲氨酸-蘇氨酸激酶)的胞外域結(jié)合。在I型受體的負調(diào)節(jié)域內(nèi)，持續(xù)活化的II受體使保守的絲氨酸磷酸化[21]。活化的I型受體反過來磷酸化下游信號分子，即受體調(diào)節(jié)的Smads或R-Smads，將信號從細胞膜傳遞至細胞核[21]。人類和其他高等脊椎動物中存在7個I型(ALK1-7)和5個II型受體(ActRIIA、ActRIIB、BMPRII、TβRII、AMHRII)。I型受體ALK1、ALK2、ALK3和ALK6主要與BMPs和生長分化因子結(jié)合，并激活R-Smads 1、5、8，而ALK4、ALK5、ALK7與活化素類、肌肉生長抑制素和TGF-βs等配體結(jié)合，并激活R-Smads 2和3。活化的R-Smads與其共同伙伴Smad4形成一個復(fù)合物，并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，在核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[21]。

ALK1最初被描述為TGF-β受體，因為TGF-β1和TGF-β3能激活A(yù)LK1胞外域(ECD)/ALK5胞內(nèi)域(ICD)嵌合受體[21]；同時，TGF-β1可以增強內(nèi)皮細胞中ALK1/ALK5復(fù)合體的形成，并激活A(yù)LK1介導(dǎo)的Smad1/5/8磷酸化[21]。然而，TGF-β作為ALK1配體，在體內(nèi)的生理意義還不清楚。最近發(fā)現(xiàn)，BMP9和BMP10是ALK1生理相關(guān)的配體。BMP9和BMP10生長因子域同源二聚體是TGF-β家族唯一與ALK1高度結(jié)合的配體[25]。

2.2ALK1與ALK5Smads 1和5信號傳導(dǎo)由ALK1磷酸化誘導(dǎo)，與Smad2/3產(chǎn)生對抗作用。內(nèi)皮細胞中ALK1過表達可減少ALK5的信號傳遞，然而內(nèi)皮細胞中ALK5過表達卻增加ALK1信號傳遞[26]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β激活A(yù)LK5-Smad2/3和ALK1-Smad1/5/8通路，從而分別抑制與激活內(nèi)皮細胞的遷移和增殖。然而，ALK1和ALK5的表達方式不同，預(yù)示它們具有獨立的信號傳遞通路[26]。

2.3ALK1與內(nèi)皮糖蛋白III型受體endoglin是TGF-β家族多個配體的輔助受體，所有配體中endoglin可以分別與BMP9和BMP10生長因子同源二聚體結(jié)合[21]。結(jié)構(gòu)研究表明，在沒有endoglin時，II型受體從BMP9或BMP10生長因子的功能前區(qū)取代它們，反之，與I型受體ALK1結(jié)合，形成信號復(fù)合體。當endoglin存在時，能促進BMP9與ALK1結(jié)合并增強信號傳遞；endoglin結(jié)合循環(huán)的BMP9或BMP10前復(fù)合體，從功能前區(qū)取代生長因子同源二聚體。這種由endoglin調(diào)控的對BMP9或BMP10同源二聚體在膜上的定位能促進ALK1的結(jié)合；最后，II型受體結(jié)合并取代endoglin，形成I型-II型受體信號復(fù)合體。然而，II型受體是如何取代endoglin以及膜粘附是如何影響這個過程的都還未知。

3　ALK1與心血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)

內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞之間的關(guān)系成為血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮的主要作用是分泌一些物質(zhì)，如血管舒張劑(NO、EDHF、PGE2)和血管收縮劑(TBXA2、內(nèi)皮素)，從而促進平滑肌細胞收縮或舒張[27]。

3.1ALK1與內(nèi)皮細胞ALK1表達增加可促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[26]。ALK1胞外域的嵌合蛋白能減少血管形成和限制腫瘤體積，作為有效的抗血管再生復(fù)合物，能減少新血管形成[28]。Endoglin+/-小鼠心肌梗死后血管再生受損，發(fā)現(xiàn)endoglin缺乏會下調(diào)TGF-β/ALK1信號通路，抑制內(nèi)皮細胞增殖[29]。相反，也有文獻報道，活化的ALK1，通過Smad1/5磷酸化，抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細胞和其他組織內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和粘附，對血管再生的成熟階段產(chǎn)生影響[30]；ALK1基因劑量的減少(雜合ALK1+/-小鼠)導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖和血管增生增強[31]。ALK1與血管再生的關(guān)聯(lián)存在相反的實驗證據(jù)，可能與不同實驗時使用的細胞類型和環(huán)境不同有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，BMP9/ALK1可阻止PI3K/AKT和VEGF引起的ERK激活。相反，藥物抑制PI3K足以消除體內(nèi)ALK1誘導(dǎo)的血管增生。PTEN是可以抵消內(nèi)皮細胞PI3K信號通路的主要脂質(zhì)蛋白磷酸酶。研究還發(fā)現(xiàn)，BMP9/ALK1通過刺激PTEN活性抑制PI3K信號級聯(lián)[32]。而這并非BMP9/ALK1獨有，因為之前研究已經(jīng)證明DLL4/Notch也會誘導(dǎo)PTEN表達而抑制柄細胞增殖[33]。 考慮到先前ALK1和Notch之間的相互作用，BMP9刺激引起PTEN增加可解釋為Notch引起的間接反應(yīng)。然而，不能排除BMP9刺激時Smad對PTEN啟動子的直接影響。事實上，VEGF通過增加內(nèi)皮細胞中miR-17-92基因簇的聚集抑制PTEN表達[34]。因此，也可能是BMP9/ALK1通過抑制PTEN表達的負向調(diào)節(jié)因子來調(diào)控PTEN量。研究確定內(nèi)皮細胞中BMP9/ALK1和PTEN之間的相互作用，對闡明ALK1表達缺失致血管增生的發(fā)病機制至關(guān)重要。

另有研究發(fā)現(xiàn)，Dkk-3(一種腫瘤抑制因子)通過激活A(yù)LK1受體而使Smad1,5,8磷酸化，誘導(dǎo)Smad4聚集在VEGF啟動子上，上調(diào)VEGF轉(zhuǎn)錄水平而作用于內(nèi)皮細胞，反過來，通過活化VEGFR2調(diào)控血管再生活性[35]。此外，TGF-β中和實驗證明Dkk-3介導(dǎo)的ALK1受體活化不需要Dkk-3和TGF-β 相互作用。此外，內(nèi)皮細胞中Dkk-3介導(dǎo)的ALK1激活和VEGF上調(diào)不需要TGF-β 。因此，Dkk-3是否為TGF-β 受體的直接激活因子，或其是否作用于另一種激活A(yù)LK1的膜受體仍然有待確定。Dkk-3與ALK1在內(nèi)皮細胞中的功能聯(lián)系提示Dkk-3在血管病理中發(fā)揮一定的作用。在病理條件下，Dkk-3可能通過增強Smad1，Smad5和Smad8磷酸化促進血管重構(gòu)。

3.2ALK1與平滑肌細胞ALK1雖然主要在內(nèi)皮細胞表達，然而ALK1對血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用并非全由內(nèi)皮介導(dǎo)。ALK1也調(diào)節(jié)平滑肌細胞的分化和聚集[36]。ALK1也誘導(dǎo)血管間質(zhì)細胞(vascular mesenchymal cells，VMCs)中基質(zhì)Gla蛋白的表達[26]，促進VMCs增殖和分化。ALK1過表達能誘導(dǎo)ALK5的表達，從而上調(diào)α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達。在人主動脈平滑肌細胞中，TGF-β通過Smad2/3和Smad1/5通路誘導(dǎo)平滑肌細胞分化(其標記因子為α-SMA和鈣調(diào)節(jié)蛋白)，ALK1不參與這一過程而ALK5參與[37]，這表明TGF-β1可能激活Smad1/5，此時該通路與ALK1無關(guān)。因此，ALK1在平滑肌細胞分化中的作用有待深入研究。

4　ALK1與心血管疾病

4.1ALK1與肺動脈高壓HHT與血管擴張、動靜脈畸形、血管阻力低及可能的左心衰有關(guān)。相比之下，肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)的特點是肺動脈毛細血管增殖、血管收縮增強，從而導(dǎo)致阻力高、心排血量低及右心衰[38]。編碼BMPR2和ALK1的基因突變與PH有關(guān)[26]。文獻報道，Acvrl1胚胎體細胞鑲嵌體的特點是兩個不同的突變等位基因來自相同的單體型，因此能夠解釋HHT與PH的相關(guān)性；在外顯子10內(nèi)發(fā)現(xiàn)了兩個相鄰的致病雜合突變，突變在細胞隔離前發(fā)生，進而導(dǎo)致體細胞和生殖系組織基因鑲嵌。相較于攜帶BMPR2突變體的PH患者，攜帶Acvrl1突變體的PH患者早期預(yù)后較差[39]。然而，矛盾的是，很少有患者出現(xiàn)HHT/PH綜合征[40]。從遺傳的角度來看，這種關(guān)系存在一定的意義，BMPR2編碼可以與ALK1結(jié)合的II型受體，BMPR2雜合突變占70%以上的遺傳性PH，20%的Acvrl1突變與PH發(fā)生有關(guān)。在極少數(shù)情況下，Acvrl1突變導(dǎo)致先天性PH或不患HHT的遺傳性PH[41]。出現(xiàn)HHT/PH的患者大多存在Acvrl1基因雜合突變，而較少的患者存在BMPR2突變[21]。

PH時EDN1表達上調(diào)。EDN1是強有力的血管收縮劑和促細胞分裂劑，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞遷移和血管再生[42]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β通過ALK5/Smad3通路誘導(dǎo)EDN1表達，TGF-β抗遷移和抗增殖作用是由EDN1對內(nèi)皮細胞的自分泌功能來調(diào)控的[43]。此外，BMP9以與TGF-β1相同的方式增加人肺微血管內(nèi)皮細胞的EDN1產(chǎn)生，但當兩者在一起，會進一步增加EDN1水平[44]。BMP9不僅通過ALK1受體誘導(dǎo)Smad1/5磷酸化，與TGF-β一樣，也誘導(dǎo)Smad2的磷酸化。也有研究發(fā)現(xiàn)，BMP9可刺激人肺動脈內(nèi)皮細胞中EDN1的釋放，由Smad1和p38 MAPK介導(dǎo)，與Smad4途徑無關(guān)；EDN1釋放部分通過BMPRII和ALK1調(diào)節(jié)[45]。BMPRII功能障礙對EDN1基礎(chǔ)水平的調(diào)節(jié)非常重要，因此對PH的發(fā)病機制也同樣重要。

最近研究發(fā)現(xiàn)，抗小鼠ALK1胞外域的抗體(anti-mALK1)與ALK1細胞外區(qū)域結(jié)合，抑制小鼠肺動脈平滑肌細胞中TGFβ介導(dǎo)的Smad1/5磷酸化和核定位，說明ALK1調(diào)控小鼠肺動脈平滑肌細胞中TGFβ引起的Smad1/5磷酸化，這與之前在人主動脈平滑肌細胞的觀察結(jié)果相反[46]。

4.2ALK1與動脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，ALK1在動脈彎曲和分支點的表達較強，而這些部位是易發(fā)生動脈粥樣硬化的擾流位點[47]。另有研究表明，ALK1在內(nèi)皮、新生內(nèi)膜和人冠狀動脈粥樣硬化病變的血管中層表達增加[48]。有趣的是，也有研究發(fā)現(xiàn)ALK1細胞外域的頂端可以相對低的親和力與含有ApoB100的循環(huán)低密度脂蛋白(LDL)結(jié)合，同時還能調(diào)控LDL轉(zhuǎn)胞吞至內(nèi)皮下的作用，從而啟動動脈粥樣硬化病變[45]。此作用不需要BMP9/BMP10、endoglin、BMPRII和ALK1激酶活性，以LDL/ALK1間的相互作用為目標可能發(fā)現(xiàn)防治動脈粥樣硬化新靶點。

研究表明，抑制BMP信號傳遞可減少動脈粥樣硬化斑塊的形成。由于ALK1調(diào)節(jié)LDL吸收是通過在胞外直接與之結(jié)合，同時還傳遞BMP信號，所以ALK1在動脈粥樣硬化的發(fā)展中至少發(fā)揮兩個獨立的功能。由于ALK1基因敲除會使早期胚胎血管缺陷及引起內(nèi)皮細胞死亡，所以關(guān)于ALK1缺失是否影響體內(nèi)LDL消除和動脈粥樣化形成仍有待深入研究[49]。

4.3ALK1與高血壓高血壓和ALK1配體TGF-β之間存在密切關(guān)系。TGF-β1應(yīng)急調(diào)控可誘導(dǎo)血管舒張并降低血壓[50]。然而，TGF-β1表達增加與血壓升高有關(guān)，TGFβ中和抗體可降低高血壓大鼠血壓[51]。血管緊張素II (angiotension II，Ang II)和醛固酮是血壓的重要調(diào)控者，可增加TGF-β1的mRNA表達并使其轉(zhuǎn)化為活性形式；Ang II也增加TGF-βII型受體mRNA的表達[52]。不僅ALK1的配體TGF-β1，ALK1本身也與高血壓具有密切聯(lián)系。ALK1受體與血壓的調(diào)控有關(guān)，ALK1+/-小鼠的血壓增高，主要是因為交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素系統(tǒng)的的激活以及膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量減少有關(guān)[53]。

4.4ALK1與心力衰竭心臟纖維化使心衰患者心肌僵硬，由于肌細胞分離使心肌收縮紊亂，阻斷離子通道，加重組織缺氧?？刂菩呐K纖維化最有效的促纖維細胞因子是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)家族。TGF-β1主要通過TGF-β II型受體(TGFβR2)、TGF-β I型受體(活化素受體樣激酶5，ALK5) 和Smad2/3傳遞信號，促進心肌I型膠原蛋白的產(chǎn)生和心肌纖維化。研究表明，TGFβ-1/ALK5在成纖維細胞中傳遞信號需要TGF-β共受體endoglin，并且降低endoglin水平能通過減弱Smad2/3的信號傳遞從而抑制心肌纖維化[54]。研究表明，心衰患者和壓力負荷小鼠模型的ALK1水平降低會進一步引起心衰，ALK1表達降低與心臟功能受損和心臟纖維化加重相關(guān)，此外，ALK1可能通過維持心衰中的Smad1活性來抑制心肌纖維化[55]。最近研究發(fā)現(xiàn)，ALK2在心肌細胞中表達并調(diào)控鈣調(diào)磷酸酶激活，特異性敲除心肌細胞ALK2會減少血管緊張素II引起的小鼠心肌肥大和心臟纖維化，特異性敲除心肌細胞的ALK1則無表型影響[56]。這些發(fā)現(xiàn)提示，ALK1可能是心肌纖維化的一個重要負調(diào)控因子，ALK1在非肌細胞的表達可能對心臟重構(gòu)至關(guān)重要。

敲除小鼠全身ALK1導(dǎo)致早期死亡和高輸出性心力衰竭，這是由于動靜脈畸形的發(fā)展及與內(nèi)臟出血有關(guān)。在HHT2表型小鼠模型中的研究證明了充血性心力衰竭是適應(yīng)性而非不適性重構(gòu)，因為是高輸出性心力衰竭[57]。近來ALK1抑制劑已經(jīng)開發(fā)用于癌癥治療。不適性心臟重構(gòu)常與化療有關(guān)，臨床研究發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)收縮期心力衰竭的患者接受ALK1抑制劑治療時必須排除高輸出性心力衰竭。高輸出性心力衰竭是HHT2患者最常見的死亡率增加的并發(fā)癥[58]。

5　結(jié)論與展望

最初Acvrl1和endoglin是作為HHT的致病基因而發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，ALK1對心血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響不僅是由于其對內(nèi)皮細胞生物學的重要作用，ALK1也調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞生物學。ALK1在炎癥細胞、心肌細胞、成纖維細胞中也發(fā)揮作用，最近報道了第一個選擇性的ALK1抑制劑San78-130，通過抑制ALK抑制肌成纖維細胞BMP-9/Smad1/5信號通路，也可促進離體血管新生[59]，說明其可能與其他重要的心血管疾病也存在聯(lián)系，可能是心血管疾病的新靶點。