楊喜永 劉雅文 趙小燕 武崇文 鄭錫銘

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種病因復(fù)雜、受多因素影響，以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性、自身性免疫疾病，主要侵害關(guān)節(jié)滑膜和組織軟骨[1，2]。miR-203作為一種小片段單鏈非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNA的翻譯來調(diào)控靶基因的蛋白表達(dá)，與包括自身免疫性疾病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）作為蛋白水解酶家族的一員，在RA 的發(fā)病過程中，能夠降解關(guān)節(jié)軟骨，促進(jìn)血管生成，臨床上可用于滑膜損傷、病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的評(píng)估[4]。本研究旨在探討關(guān)節(jié)滑膜液miR-203和MMP-3在RA患者中的表達(dá)及其臨床意義。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2016年11月～2017年5月我院住院的RA患者60例，均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)及歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟 (ACR/EULAR)共同修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，其中男18例，女42例；年齡26～63歲，平均(45.8±6.7)歲。統(tǒng)計(jì)患者28關(guān)節(jié)腫脹數(shù)（SW28）、28關(guān)節(jié)壓痛數(shù)（T28）、總體健康評(píng)定（GH），計(jì)算 DAS28，DAS28＜2.6為穩(wěn)定組，DAS28＞2.6為活動(dòng)組，其中穩(wěn)定組30例，活動(dòng)組30例。選取我院同期健康志愿者30例作為對(duì)照組，年齡28～58歲，平均(45.1±8.3)歲。選取的研究對(duì)象均排除其他自身免疫性疾病和重要器官系統(tǒng)疾病，兩組一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上樣本的收集均獲得患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2主要試劑及儀器 自動(dòng)免疫分析儀、自動(dòng)血沉分析儀檢測(cè)(Beckman Coulter公司)。Small RNA試劑盒(TaKaRa公司)；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-CR熒光定量試劑盒、Nano-Drop17(賽默飛公司)；Analytic jena熒光定量PCR儀(伯樂公司) 。所有引物均由上海生工公司合成。

1.3方法

1.3.1Small RNA提取及cDNA合成 患者及健康志愿者在無菌條件下行膝關(guān)節(jié)穿刺，抽取關(guān)節(jié)液后，1 000r/min離心10min，取上清液置-20℃保存?zhèn)溆谩０丛噭┖胁僮髡f明書提取Small RNA作為模板，使用莖環(huán)特異性引物，參照Thermo Scientific反轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行cDNA合成，反轉(zhuǎn)錄條件為42℃，60min，70℃ 5min，4℃保存。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建及RT-PCR檢測(cè) 以miR-203 mimics作為標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋構(gòu)建10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 濃度梯度，取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 2μl作為模板，與樣本同時(shí)行反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用Top Green qPCR SuperMix反應(yīng)體系：Top Green qPCR SuperMix 10μl，上、下游引物各1.0μl，模板 2μl，加水至 20μl。反應(yīng)條件為：95℃30s 1 個(gè)循環(huán)；95℃ 5s，62℃ 30s ，72℃ 30s 40 個(gè)循環(huán)；設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，檢測(cè)結(jié)果取平均值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行qPCR定量分析。

1.3.3臨床指標(biāo)檢測(cè) ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜液MMP-3及外周血RF和ACCP抗體，魏氏法檢測(cè)血沉（ESR），免疫比濁法檢測(cè) C 反應(yīng)蛋白（CRP），所有操作嚴(yán)格按照儀器及配套試劑說明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用±s表示，所有數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Pearson相關(guān)系數(shù)分析各檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性。

2　結(jié)果

2.1關(guān)節(jié)滑膜液miR-203、MMP-3及相關(guān)臨床指標(biāo)的表達(dá) 相對(duì)于對(duì)照組，RA患者關(guān)節(jié)滑膜液miR-203、MMP-3及血漿RF、ACCP、ESR和CRP表達(dá)顯著升高，見表1。

表 1 miR-203、MMP-3 及相關(guān)臨床指標(biāo)的表達(dá)（±s）

表 1 miR-203、MMP-3 及相關(guān)臨床指標(biāo)的表達(dá)（±s）

注：-表示未統(tǒng)計(jì)

項(xiàng)目　RA組（n=60）　　對(duì)照組(n=30)　t　P miR-203(cope/μl)　2418.46±268.991622.46±555.22　9.188　＜0.001 MMP-3(ng/L)216.96±38.67　147.90±37.39　8.075?。?.001 RF(IU/ml)　46.24±28.80　4.16±2.54　5.999　＜0.001 ACCP(IU/ml)　74.55±43.62　4.16±2.54　8.805?。?.001 ESR(mm/h)　42.22±27.27　10.70±4.29　6.273　＜0.001 CRP(mg/ml)　31.97±12.15　3.14±1.28　12.919　＜0.001 DAS28　4.183±1.63　-　-　-

2.2關(guān)節(jié)滑膜液miR-203、MMP-3及相關(guān)臨床指標(biāo)在不同時(shí)期的表達(dá)水平 活動(dòng)期患者關(guān)節(jié)滑膜液miR-203、MMP-3及血漿 RF、ACCP、ESR和 CRP表達(dá)水平高于穩(wěn)定期，見表2。

表2　不同時(shí)期miR-203、MMP-3及相關(guān)臨床指標(biāo)的表達(dá)（±s）

表2　不同時(shí)期miR-203、MMP-3及相關(guān)臨床指標(biāo)的表達(dá)（±s）

項(xiàng)目　　活動(dòng)期（n=30）　穩(wěn)定期(n=30)　t　P miR-203(cope/μl)　2609.30±245.462227.62±107.72　7.799　?。?.001 MMP-3(ng/L)234.70±36.05　199.22±33.03　3.974　?。?.001 RF(IU/ml)　63.26±27.90　29.21±17.60　5.653　?。?.001 ACCP(IU/ml)　95.95±33.73　53.15±42.26　4.335　　＜0.001 ESR(mm/h)　45.40±24.15　39.03±30.16　0.903　0.370 CRP(mg/ml)　39.95±7.66　23.98±10.49　6.732　　＜0.001 DAS28　5.93±1.17　3.72±1.25　7.065　?。?.001

2.3miR-203及MMP-3與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析顯示：關(guān)節(jié)滑膜液miR-203與MMP-3、RF、ACCP、ESR、CRP及DAS28顯著相關(guān)；關(guān)節(jié)滑膜液MMP-3與RF、ACCP、ESR、CRP及DAS28存在顯著相關(guān)性，見表3。

表3　miR-203、MMP-3與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4miR-203和MMP-3的 ROC曲線分析 為評(píng)估關(guān)節(jié)滑膜液miR-203和MMP-3對(duì)RA的診斷價(jià)值，對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行ROC分析，見表4。miR-203診斷臨界值為2 162.68(cope/μl)時(shí)，靈敏度為98.33%，特異度為83.33%； MMP-3診斷臨界值為155.95 (ng/L)時(shí)，靈敏度為86.67%，特異度為93.33%。見圖1。

表4　RA患者miR-203、MMP-3、ACCP、RF的ROC曲線分析

圖 1 關(guān)節(jié)滑膜液 miR-203、MMP-3、ACCP、RF 的ROC曲線分析

3　討論

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類小片段單鏈非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNA的翻譯來調(diào)控靶基因的蛋白表達(dá)，參與多種炎性反應(yīng)過程和自身免疫性疾病的發(fā)病過程，在多種炎性和自身免疫功能調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[6，7]。Stanczyk等[8]發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜組織中miR-203上調(diào)表達(dá)，并促進(jìn)MMP-1和IL-6的表達(dá)，其中IL-6的高表達(dá)受NF-κB信號(hào)通路的影響，表明miR-203通過NF-κB信號(hào)通路對(duì)滑膜組織發(fā)揮作用，同時(shí)miR-203可以增加MMPs的產(chǎn)生，在關(guān)節(jié)破壞方面發(fā)揮重要作用。

作為基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族的重要成員，MMP-3可以加劇炎癥反應(yīng)、分解破壞細(xì)胞內(nèi)皮基膜，降解蛋白聚糖等非膠原的基質(zhì)成分，促進(jìn)骨的重建及血管翳的形成[9]。在RA早期就有大量成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞一起分泌MMP-3，使得滑膜液和血液中MMP-3明顯升高，促進(jìn)血管翳的形成，侵蝕關(guān)節(jié)軟骨，引起骨組織的破壞，同時(shí)MMP-3的活化可以使MMP-9產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，加劇炎性反應(yīng)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3可預(yù)示早期RA患者在檢測(cè)該項(xiàng)指標(biāo)增高6～12個(gè)月內(nèi)可出現(xiàn)關(guān)節(jié)不同程度的破壞[11]。

本研究結(jié)果顯示，RA患者關(guān)節(jié)滑膜液miR-203、MMP-3的水平高于對(duì)照組，且活動(dòng)期的表達(dá)水平高于穩(wěn)定期，表明其水平變化對(duì)于臨床了解患者的病情具有一定指導(dǎo)意義；miR-203、MMP-3與RA傳統(tǒng)診斷指標(biāo)RF、ACCP、ESR和CRP及疾病活動(dòng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)DAS28存在顯著正相關(guān)，說明關(guān)節(jié)滑膜液中miR-203、MMP-3參與了RA的炎癥反應(yīng)，其水平可直接反映患者的關(guān)節(jié)炎癥和破壞情況，且兩者存在顯著正相關(guān) （r=0.678，P＜0.001）。 miR-203高表達(dá)可以促進(jìn)IL-6的生成，后者可以上調(diào)MMP-3的表達(dá)[12]。這提示可以通過干預(yù)miR-203的表達(dá)水平進(jìn)而調(diào)節(jié)MMP-3表達(dá)，從而為RA提供新治療手段。

通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，RF曲線下面積為0.884，以20.00 IU/ml作為診斷臨界值時(shí)，診斷靈敏度和特異度分別為71.67%和86.67%， ACCP曲線下面積為0.936，以5.00 IU/ml作為診斷臨界值時(shí)，診斷靈敏度和特異度分別為83.33%和96.67%，均與檢測(cè)試劑盒一致。關(guān)節(jié)滑膜液miR-203和MMP-3曲線下面積分別為0.905和0.913，表明其對(duì)RA具有很強(qiáng)的臨床診斷能力，聯(lián)合檢測(cè)具有更強(qiáng)的臨床診斷價(jià)值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜液miR-203和MMP-3在RA患者中存在差異表達(dá)，其表達(dá)水平可作為疾病活動(dòng)有效監(jiān)測(cè)指標(biāo)及潛在診斷指標(biāo)。miR-203可上調(diào)MMP-3表達(dá)，在疾病過程中發(fā)揮重要作用，但由于本組臨床樣本數(shù)量較少，有待于進(jìn)一步大樣本進(jìn)行驗(yàn)證，以便為RA提供新的臨床診斷指標(biāo)和潛在治療的新方向。