李應(yīng)洪 李忠海 付湘晉 張 慧

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004)

中國樟樹資源豐富，目前主要是用于綠化、木料加工及提取芳樟油，大量加工下腳料(枝、葉)未被利用。樟樹葉含有大量酚類物質(zhì)，是新的多酚資源[1-2]。多酚對(duì)多種細(xì)菌、真菌、酵母菌有明顯的抑制作用。Singh等[3]發(fā)現(xiàn)肯氏蒲桃多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、克雷伯氏肺炎菌、佛里德蘭德氏桿菌、白色念珠菌顯示了較好的廣譜抗菌效果，抑菌直徑為14.3～23.0 mm，最小抑菌濃度為0.5～2.5 mg/mL。Aziz Shahid等[4]從紅花百里香中分離出酚類化合物，其中迷跌香酸對(duì)化膿性鏈球菌顯出很好的抗菌活性。棗漿中多酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度分別為(MIC)30，20 mg/mL[5-6]。這些結(jié)果表明，多酚提取物作為天然抑菌劑在食品保鮮領(lǐng)域具有潛在的研究和開發(fā)價(jià)值。已有研究[7-8]報(bào)道，樟樹葉多酚具有優(yōu)良的抗氧化活性，但其抗菌活性還未見報(bào)道。

本試驗(yàn)擬研究樟樹葉多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、黑曲霉、大腸埃希菌、熒光假單胞菌等7株常見致病菌、腐敗菌的抑菌活性，以及其對(duì)草魚肉的保鮮作用，為開發(fā)天然抗菌保鮮劑提供參考，也為樟樹葉高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

樟樹葉多酚提取物：本實(shí)驗(yàn)室自制[2,9-10];

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、青霉、毛霉：由中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供；

草魚：2～3 kg/尾，鮮活，市售。

1.2 方法

1.2.1 多酚對(duì)試驗(yàn)菌株的抑菌作用 根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]，采用試管法測定最低抑菌濃度(MIC)，采用平皿法測定最低殺菌濃度(MBC)。

1.2.2 樟樹葉多酚對(duì)草魚片的保鮮作用 分別取5，10 g 樟樹葉多酚定容至100 mL，得濃度分別為50，100 mg/mL的樟樹葉多酚保鮮液。

鮮活草魚宰殺后，去頭、去尾、去內(nèi)臟，清洗，切成3 cm×3 cm的魚塊，30 min內(nèi)進(jìn)行樟樹葉多酚涂抹處理完畢，冷藏于4 ℃冰箱，使魚肉中多酚濃度達(dá)到5，10 μL/g。

1.2.3 魚片菌落總數(shù)測定 按GB 4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)的測定》執(zhí)行。樣品的菌落計(jì)數(shù)選擇營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h。

1.2.4 魚片pH的測定 取絞碎的草魚魚肉5.0 g于燒杯中，加入45 mL去CO2的蒸餾水，攪拌、浸漬30 min，過濾靜置后用pH計(jì)測其上清液pH值[12]。

1.2.5 魚片揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)值的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[12]，采用半微量定氮法測定。

1.2.6 魚片TMA值的測定 采用苦味酸法測定[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用3次平行試驗(yàn)的平均值，使用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟樹葉多酚最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)

本試驗(yàn)選取了常見食品腐敗菌或致病菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌、大腸埃希菌、青霉、黑曲霉、毛霉7株微生物進(jìn)行研究，結(jié)果見表1。從表1可以看出，樟樹葉多酚對(duì)試驗(yàn)菌株均有明顯抑制作用，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道中其它植物多酚基本一致。樟樹葉多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、青霉、黑曲霉、毛霉等均有明顯抑制作用，抑制效果順序?yàn)椋簾晒饧賳伟?枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌=大腸埃希菌>青霉=黑曲霉=毛霉，最小抑菌濃度分別為0.500，0.625，1.250，2.500 mg/mL。熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)是草魚冷藏過程中最主要的腐敗菌[13-14]；樟樹葉多酚對(duì)熒光假單胞菌的最小抑菌濃度只有0.500 mg/mL，最小殺菌濃度為1.000 mg/mL；所以可以預(yù)計(jì)，樟樹葉多酚可作為靶向抑菌劑用于草魚保鮮。

2.2 樟樹葉多酚對(duì)草魚魚片的保鮮效果

因?yàn)檎翗淙~多酚對(duì)草魚冷藏過程中最主要的腐敗菌[13-14]熒光假單胞菌有明顯抑制作用；所以，進(jìn)一步研究了樟樹葉多酚對(duì)冷藏草魚魚片的保鮮效果。測定了樟樹葉多酚對(duì)冷藏過程草魚片中細(xì)菌總數(shù)、pH、TVB-N、TMA的影響，結(jié)果分別見圖1～4。

表1樟樹葉多酚的最小抑菌濃度、最小殺菌濃度

Table 1 The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of camphor tree leaves’ polyphenol

mg/mL

2.2.1 對(duì)冷藏草魚魚片菌落總數(shù)的影響 菌落總數(shù)測定結(jié)果(圖1)表明，樟樹葉多酚處理明顯改變了魚片中菌落總數(shù)的變化趨勢，空白樣品菌落總數(shù)一直快速增加，但樟樹葉多酚處理魚肉在貯藏初期菌落總數(shù)增長緩慢，有一個(gè)明顯的延滯期，5，10 mg/g樟樹葉多酚添加量魚片的延滯期分別是2，4 d；表明樟樹葉多酚能有效抑制魚肉中微生物的繁殖、生長。以魚肉菌落總數(shù)超過6 lg CFU/g為限值[12]；空白對(duì)照魚片菌落總數(shù)4 d即超過6 lg CFU/g；5，10 mg/g樟樹葉多酚添加量魚片分別在第6、9天超過6 lg CFU/g，所以，樟樹葉多酚可延長魚肉冷藏貨架期。

圖1 樟樹葉多酚對(duì)冷藏草魚菌落總數(shù)的影響Figure 1 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the colony count of Grass carp

2.2.2 對(duì)冷藏草魚魚片pH值的影響 由圖2可知，魚片初始pH值約6.50，空白對(duì)照魚片pH值一直緩慢增加；樟樹葉多酚處理明顯改變了魚片pH值變化趨勢，貯藏初期(2 d內(nèi))，pH值有一降低的過程，此后才緩慢升高，與茶多酚保鮮的草魚肉pH值變化趨勢一致[15]。魚肉pH值的變化與魚體自身酶的作用及微生物繁殖有關(guān)。pH值降低是因?yàn)轸~肉中糖類酵解產(chǎn)生乳酸，ATP和磷酸肌酸分解產(chǎn)生磷酸，pH值上升主要是由于貯藏過程中微生物利用魚肉中的蛋白質(zhì)大量生長繁殖，產(chǎn)生TVB-N和TMA等堿性含氮物質(zhì)。所以，魚肉pH值上升，間接反映了此期間魚肉中微生物的大量積累和繁殖。樟樹葉多酚延緩了冷藏魚肉pH值上升，間接表明樟樹葉多酚對(duì)魚體微生物的繁殖、生長有抑制作用。

圖2 樟樹葉多酚對(duì)冷藏草魚片pH的影響Figure 2 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the pH of Grass carp

2.2.3 對(duì)冷藏草魚魚片揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的影響 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)是評(píng)價(jià)肉制品鮮度的主要衛(wèi)生指標(biāo)，TVB-N的增加主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在細(xì)菌的繁殖和內(nèi)源性酶的作用下，分解產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)；TVB-N含量越高，表明氨基酸被破壞的越多，肉制品的腐敗程度越嚴(yán)重。不同種類魚肉的TVB-N含量可接受的上限不同[16]。周然等[17]的研究中指出鱈魚魚肉中TVB-N含量的可接受上限為60 mg/100 g，黑鱸的可接受上限為10 mg/100 g，鰱魚的可接受上限為35～40 mg/100 g。楊輝等[16]在草魚肉保鮮研究中，確定草魚TVB-N值在17 mg/100 g以下為新鮮水平。

圖3表明，在貯藏前期，魚肉的TVB-N值增長緩慢，隨著貯藏時(shí)間的延長，魚體TVB-N值的增長速度明顯高于貯藏前期，主要是因?yàn)槲⑸锎罅糠敝?，氨基酸被破壞，造成揮發(fā)性含氮物質(zhì)大量生成，使得魚肉的TVB-N值急劇上升。樟樹葉多酚處理明顯降低了魚肉TVB-N含量的升高速度，特別是在貯藏前期，5，10 mg/g樟樹葉多酚添加量的魚肉在冷藏開始的2，4 d，其TVB-N含量升高很少，因?yàn)檎翗淙~多酚處理抑制了微生物的生長繁殖，所以TVB-N增加的速度明顯降低。以TVB-N含量17 mg/100 g為限量值，則5，10 mg/g 樟樹葉多酚處理可使魚片貨架期從3 d分別延長至6，8 d。

2.2.4 對(duì)冷藏草魚魚片三甲胺(TMA)的影響 TMA有明顯的魚惡臭味，由氧化三甲胺在腐敗細(xì)菌的氧化三甲胺還原酶的作用下產(chǎn)生。TMA也是評(píng)價(jià)魚肉鮮度的重要衛(wèi)生指標(biāo)，TMA含量越高，其鮮度越差。圖4表明，樟樹葉多酚處理明顯延緩了TMA升高的速度；對(duì)照樣品從貯藏開始，TMA值即呈明顯上升趨勢，2 d后加速上升；樟樹葉多酚處理魚片樣品在貯藏期前6 d，TMA值均只有緩慢升高。

圖3 樟樹葉多酚對(duì)冷藏草魚TVB-N含量的影響Figure 3 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the TVB-N of Grass carp

圖4 樟樹葉多酚對(duì)冷藏草魚片TMA的影響Figure 4 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the TMA of Grass carp

3 結(jié)論

樟樹葉多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、青霉、黑曲霉、毛霉均有明顯抑制作用；特別對(duì)熒光假單胞菌的最小抑菌濃度只有0.500 mg/mL，最小殺菌濃度為1.000 mg/mL。樟樹葉多酚5，10 mg/g處理可分別使冷藏魚片貨架期從3 d延長至6，8 d；樟樹葉多酚可作為魚肉靶向抑菌劑，具有進(jìn)一步研究和開發(fā)價(jià)值。但樟樹葉多酚的單體組成及其抑菌機(jī)制還需進(jìn)一步研究。