劉芳芳 李范洙 張 先 李 敏

(1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2. 延邊特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，吉林 延吉 133000)

生物質(zhì)熱解液(簡稱熱解液)是農(nóng)林廢棄物如秸稈、鋸末、雜木等生物質(zhì)在一定條件下快速熱解得到生物油在精制過程中的水溶性組分[1]，其化學(xué)組成主要包括有機(jī)酸類、酮類、酚類、醇類等化合物[2]，類似于醋液[3]。據(jù)報道木醋液、竹醋液具有促進(jìn)植物生長、抑制植物病原菌及保鮮的作用[4-5]，相較于其他農(nóng)藥殘留難去除[6]的問題，木醋液毒性小、無殘留，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，尤其是綠色農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中[7-9]。但對熱解液在抑制植物病原菌和果蔬保鮮方面的研究報道并不多，李金娜等[10]研究了熱解液采前處理對蘋果梨貯藏品質(zhì)的影響，表明熱解液對蘋果梨起到了保鮮作用；張先等[11]研究表明采后熱解液處理對香水梨具有一定的保鮮效果，因此推測熱解液可能對其他果實(shí)的貯藏保鮮有一定的作用。甜瓜營養(yǎng)豐富，汁多味甜，備受廣大消費(fèi)者青睞，中國是世界上最大的甜瓜產(chǎn)區(qū)[12]。甜瓜在生產(chǎn)貯藏及運(yùn)輸過程中常發(fā)生一些病害，其中甜瓜炭疽菌(Colletorichumorbiculare)是主要病害之一[13]。甜瓜炭疽菌是真菌中的半知菌亞門刺盤孢菌，在甜瓜全生育期都可誘發(fā)炭疽病的發(fā)生，造成甜瓜嚴(yán)重腐爛，另外由于采收期集中，且正值高溫季節(jié)，所以甜瓜還存在不耐運(yùn)輸、貯藏時間短、易軟化等問題[14]。目前農(nóng)民習(xí)慣頻繁施用化學(xué)藥劑對甜瓜炭疽病進(jìn)行防治，既增加防治成本，又加重果品污染，防效也不理想[15]，而在保鮮方面中國采用普通冷藏、化學(xué)保鮮劑等[16]，均存在效果不佳、化學(xué)殘留等問題。另外天然保鮮劑如天然樹脂、殼聚糖、魔芋精粉等涂膜處理雖然能對甜瓜起到保鮮作用，但涂膜必須薄厚均勻，過厚會影響果蔬的呼吸作用，導(dǎo)致生理代謝失調(diào)，引起腐爛變質(zhì)，只能在短期貯藏、運(yùn)輸或上市前進(jìn)行處理[17]，且存在風(fēng)干時間長、占地面積大等不足。而熱解液與上述天然保鮮劑相比于果蔬采前采后均可進(jìn)行經(jīng)噴灑或浸泡處理，且易風(fēng)干。根據(jù)熱解液處理蘋果、梨的貯藏品質(zhì)研究試驗(yàn)可以看出熱解液可以延長貯藏期。因此合理有效開發(fā)天然保鮮劑對甜瓜炭疽病的防治和甜瓜保鮮來說具有重要意義，而目前沒有熱解液對甜瓜保鮮的研究報道。

本試驗(yàn)擬研究熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌效果及抑菌機(jī)理，同時研究熱解液對甜瓜采后貯藏品質(zhì)的影響，以期為開發(fā)低毒無害的果蔬保鮮劑提供一定的理論參考，并為生物質(zhì)資源的綜合利用及熱解液的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

熱解液：2014年廣州迪森集團(tuán)提供的以木屑為原料，中溫快速熱解法制造的生物油，生物油與水按體積比1∶1混合，在0.1 MPa的真空度下蒸餾，收集100～120 ℃時的蒸餾液；

甜瓜：八里香薄皮甜瓜，延吉市萬源批發(fā)市場。

1.1.2 供試菌種

甜瓜炭疽菌：吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院。

1.2 儀器設(shè)備

數(shù)顯電導(dǎo)率儀：DDS-11A型，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TMS-PRO型，美國Food Technology Corporation公司；

超微量紫外分光光度計：Q5000型，美國Quawell公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌試驗(yàn) 用PDA固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50 ℃，以10倍間隔對熱解液進(jìn)行稀釋配制成熱解液濃度為0.9%～3.3%的培養(yǎng)基。用打孔器(直徑為5 mm)在已培養(yǎng)6～8 d的甜瓜炭疽菌平板上選取菌落生長旺盛處制備菌餅，之后將菌絲朝下放入含熱解液的培養(yǎng)平皿中央，以不加熱解液的培養(yǎng)基為對照(CK)，每個培養(yǎng)皿中放置一個菌餅，每個濃度重復(fù)3次，24 ℃下培養(yǎng)至對照菌菌落長到平板2/3時用十字交叉法測定菌落直徑，通過抑菌率公式計算不同濃度熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌率[18]。以熱解液濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑菌率的幾率值為縱坐標(biāo)，得到毒力回歸方程，從毒力回歸方程計算得出熱解液對甜瓜炭疽菌的EC50值和EC70值。

1.3.2 熱解液對甜瓜炭疽菌抑菌機(jī)理試驗(yàn) 用1.4%，1.7%，2.0%，2.5%的熱解液處理甜瓜炭疽菌菌絲后，使用電導(dǎo)率儀進(jìn)行電導(dǎo)率的測定[19]；參照徐俊光[20]的方法進(jìn)行細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的測定；蒽酮試劑法測定菌絲總糖含量[21]。

1.3.3 果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)的測定

(1) 果肉硬度：用質(zhì)構(gòu)儀測定，參數(shù)為檢測速度30 mm/s，測定深度6 mm，起始力0.5 N[22]。

(2) 可溶性固形物含量：用手持折光儀測定。

(3) 可滴定酸含量：用指示劑滴定法測定[23]。

1.3.4 果實(shí)生理生化指標(biāo)的測定

(1) 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性：采用鄰苯二酚氧化法[24]。

(2) 酚類物質(zhì)含量：福林試劑法[25]。

(3) 多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性：DNS比色法[26]88-89。

(4) 可溶性果膠含量：咔唑比色法[26]90。

1.4 保鮮試驗(yàn)設(shè)計

選取熱解液對甜瓜炭疽菌抑菌試驗(yàn)中確定的EC50值和EC70值，即濃度為1.8%和2.4%的熱解液對甜瓜浸泡2～3 min 后瀝干，置于室溫，每隔4 d進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，并設(shè)置對照組(CK)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel計算標(biāo)準(zhǔn)差， 應(yīng)用SPSS 17.0采用Duncan多重比較法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌作用

熱解液對甜瓜炭疽菌有較好的抑菌效果(圖1)。如表1所示，隨著熱解液濃度的增加，熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌率逐漸增大，當(dāng)熱解液濃度>2.0%時，抑菌率>50%，且差異顯著(P<0.05)，熱解液濃度為3.3%時抑菌率達(dá)到100%。通過不同濃度熱解液對甜瓜炭疽菌抑菌率的測定，求得毒力回歸方程為y=4.064 4X2+2.109 1X+4.106，R2=0.996 7，根據(jù)回歸方程得出熱解液對甜瓜炭疽菌的EC50值為1.8%，EC70值為2.4%。

圖1 熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌效果Figure 1 Inhibitory effect of bio-liquid on Colletorichum orbiculare表1 熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌率?Table 1 The bacteriostasis rate of bio-liquid against Colletorichum orbiculare

%

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌機(jī)理

2.2.1 對炭疽菌相對電導(dǎo)率的影響 相對電導(dǎo)率可表示細(xì)胞膜通透性，通過測定相對電導(dǎo)率可以看出熱解液是否破壞甜瓜炭疽菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。選取對甜瓜炭疽菌抑菌率在30%～80%的不同濃度熱解液對甜瓜炭疽菌進(jìn)行處理后測定電導(dǎo)率，從圖2可以看出病菌的相對電導(dǎo)率在處理1 h后達(dá)到高峰，之后2 h內(nèi)迅速下降，3 h后趨于平緩。1～5 h內(nèi)經(jīng)熱解液處理的病菌的相對電導(dǎo)率隨著處理濃度的增高而增大，各處理組相對電導(dǎo)率均顯著高于對照組，處理1 h后2.5%熱解液處理組相對電導(dǎo)率為56.9%，對照組為30.7%。說明熱解液破壞了甜瓜炭疽菌菌體的細(xì)胞膜，造成電解質(zhì)外滲導(dǎo)致電導(dǎo)率升高，而且處理濃度越高，對細(xì)胞膜的破壞程度越大。

圖2 熱解液對甜瓜炭疽菌相對電導(dǎo)率的影響Figure 2 Effects of bio-liquid on relative conductivity of Colletorichum orbiculare

2.2.2 對炭疽菌蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的影響 從圖3可以看出，蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的變化趨勢類似，均隨著熱解液處理時間的延長外滲量持續(xù)增加，而且熱解液濃度越大外滲量越多，各處理組的蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲量均顯著高于對照組。說明熱解液破壞甜瓜炭疽菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲，且熱解液濃度越大對細(xì)胞膜的破壞作用也越大，并且會持續(xù)一定時間。同時在甜瓜炭疽菌剛接觸到熱解液時就有蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲，說明熱解液對甜瓜炭疽菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞作用迅速。吳慧娟等[27]研究表明神農(nóng)香菊全草精油化學(xué)成分主要為萜烯類、醇類和醛酮類，抑菌機(jī)制可能在于此等物質(zhì)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞變形和菌體蛋白質(zhì)外滲。付長雪等[28]通過GS-MS對熱解液成分進(jìn)行了分析，表明熱解液主要組成成分為酸類、胺類、酮類物質(zhì)，還含有少量的醇類、酯類、酚類、醛類物質(zhì)，進(jìn)一步說明了熱解液的抑菌作用可能與其活性成分有關(guān)。

2.2.3 對炭疽菌菌絲總糖含量的影響 從圖4可以看出，不同濃度熱解液處理甜瓜炭疽菌48 h后，菌絲中總糖含量顯著低于對照組。熱解液濃度越大，菌絲總糖含量越低，其中2.5%熱解液處理組的總糖含量為1.24%，顯著低于其他濃度的。說明熱解液破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，糖類物質(zhì)滲出，導(dǎo)致總糖含量降低，與王海英等[29]對木醋液的研究結(jié)果一致。

2.3 熱解液處理對甜瓜貯藏品質(zhì)的影響

2.3.1 對果肉硬度的影響 由圖5可以看出，在貯藏期間甜 瓜果肉硬度呈下降趨勢，可能是在酶的作用下原果膠被水解生成可溶性果膠，細(xì)胞壁的纖維變得松散，果實(shí)逐漸變軟，硬度下降[30]。熱解液處理組的果肉硬度較CK組下降緩慢，貯藏8 d起熱解液處理組的硬度顯著大于CK組的，16 d時2.4% 熱解液處理組的硬度顯著大于1.8%熱解液處理組的。說明熱解液處理對甜瓜的硬度下降有保護(hù)作用，且熱解液濃度越大，硬度下降越緩慢?？赡苁菬峤庖阂种屏薖G活性，減緩了對果膠的降解，使可溶性果膠的增加受到抑制，進(jìn)而減緩了果肉硬度的下降。

圖3 熱解液對甜瓜炭疽菌蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的影響

Figure 3 Effects of bio-liquid on protein and nucleic acids extravasation ofColletorichumorbiculare

圖4 熱解液對甜瓜炭疽菌菌絲總糖含量的影響

Figure 4 Effects of bio-liquid on total sugar content ofColletorichumorbiculare

圖5 熱解液對甜瓜果肉硬度的影響Figure 5 Effects of bio-liquid on the pulp’s hardness of muskmelon

2.3.2 對可溶性固形物和可滴定酸含量的影響 可溶性固形物含量直接反映果蔬的成熟程度和品質(zhì)，可作為判斷果品適時采收和耐貯藏性的重要指標(biāo)，而酸作為果蔬中呼吸作用和能量代謝的底物，可反映出營養(yǎng)物質(zhì)被消耗的程度。由圖6可以看出，隨著貯藏時間的延長，甜瓜果實(shí)的可溶性固形物和可滴定酸含量均呈緩慢下降趨勢，且熱解液處理組的下降速度均緩于CK組的。貯藏4 d后熱解液處理組的可溶性固形物含量始終顯著高于CK組的，12 d后2.4% 熱解液處理組的含量始終顯著高于1.8%熱解液處理組的。在整個貯藏過程中熱解液處理組的可滴定酸含量始終顯著高于CK組的，且2.4%熱解液處理組的含量始終顯著高于1.8%熱解液處理組的。因此熱解液處理對甜瓜果實(shí)可溶性固形物和可滴定酸含量的下降均有明顯的抑制效果，且熱解液濃度越大抑制效果越明顯。這可能是甜瓜呼吸強(qiáng)度受到抑制從而減緩了對可溶性固形物和可滴定酸的消耗，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱解液浸泡處理的甜瓜起初有熱解液的氣味，但不影響甜瓜的香氣，因此推測熱解液會在甜瓜表面形成保護(hù)膜，起到抑制呼吸強(qiáng)度的作用。

2.4 熱解液處理對甜瓜生理生化指標(biāo)的影響

2.4.1 對PPO和PG活性的影響 PPO能催化多種酚類物質(zhì)氧化形成醌類化合物，加速果蔬的衰老進(jìn)程，降低品質(zhì)[31]102。由圖7(a)可以看出，貯藏期間甜瓜的PPO活性呈上升趨勢，且熱解液處理組的PPO活性上升速度顯著緩于CK組，貯藏8 d后2.4%熱解液處理組PPO活性上升速度顯著緩于1.8%熱解液處理組。說明熱解液處理能夠抑制PPO活性的上升，同樣熱解液濃度越大對PPO活性上升的抑制作用越明顯。

圖6 熱解液對甜瓜可溶性固形物和可滴定酸含量的影響

Figure 6 Effects of bio-liquid on the content of soluble solid and titratable acid of muskmelon

圖7 熱解液對甜瓜PPO和PG活性的影響Figure 7 Effects of bio-liquid on the PPO and PG activity of muskmelon

PG能夠水解α-(1,4)-半乳聚糖鏈的親水末端，從而導(dǎo)致果膠裂解，加速果實(shí)軟化進(jìn)程[32]。由圖7(b)可以看出，甜瓜果實(shí)中PG活性在貯藏前8 d維持一定水平，8 d后迅速上升。貯藏第8 天開始，熱解液處理組的酶活性始終顯著低于CK組的，貯藏12 d起，2.4%熱解液處理組的酶活性顯著低于1.8% 熱解液處理組的?？梢钥闯鰺峤庖簩G活性有明顯的抑制效果，且隨著貯藏時間的延長，熱解液濃度越高對PG活性的影響越大。研究[33]表明PG受乙烯的正向調(diào)控，說明熱解液可能會對乙烯產(chǎn)生抑制作用進(jìn)而抑制了PG活性。另外熱解液含有一定量的Ca[1]，劉劍鋒[34]研究表明浸Ca處理可以抑制PG酶活性，所以可能也與熱解液中的Ca有關(guān)。

2.4.2 對酚類物質(zhì)和可溶性果膠含量的影響 酚類物質(zhì)是果實(shí)中重要的抗氧化物質(zhì)，隨著貯藏時間的延長，酚類物質(zhì)被逐漸消耗。由圖8(a)可以看出，在貯藏0～4 d 時，甜瓜果實(shí)中的酚類物質(zhì)有一個緩慢上升的過程之后下降，可能是試驗(yàn)中甜瓜所處的溫度高于之前貯藏銷售環(huán)境的溫度，導(dǎo)致呼吸強(qiáng)度增大，代謝旺盛，促進(jìn)了果實(shí)內(nèi)部酚類物質(zhì)的合成，使酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)上升趨勢[35]，之后酚類物質(zhì)被消耗逐漸下降。8 d后熱解液處理組的酚類物質(zhì)含量始終顯著高于CK組，且2.4%熱解液處理組酚類物質(zhì)含量始終顯著高于1.8% 熱解液處理組。由此結(jié)果可知，熱解液處理可有效抑

圖8 熱解液對甜瓜酚類物質(zhì)和可溶性果膠含量的影響

Figure 8 Effects of bio-liquid on the phenolic substances and soluble pectin content of muskmelon

制甜瓜貯藏過程中酚類物質(zhì)的消耗，且熱解液濃度越大抑制效果越明顯。熱解液含有多種活性成分，可能和木醋液一樣也具有較強(qiáng)的抗氧化活性[36]，從而減緩了氧化進(jìn)程，對酚類物質(zhì)的消耗起到了一定的抑制作用。另外試驗(yàn)結(jié)果表明PPO活性被抑制，從而也對酚類物質(zhì)的消耗起到了延緩作用。

果實(shí)在成熟過程中，PG可催化果膠降解，從而使可溶性果膠含量增加，果肉硬度下降，加快果實(shí)軟化程度[31]100。由圖8(b)可以看出，甜瓜果實(shí)的可溶性果膠含量隨著貯藏時間的延長而逐漸增加，貯藏4 d后，熱解液處理組的可溶性果膠含量顯著低于CK組的，貯藏8 d后2.4%熱解液處理組的可溶性果膠含量顯著低于1.8%熱解液處理組的。因此可以看出熱解液處理后可以明顯抑制可溶性果膠含量的增加，而且熱解液濃度越大抑制效果越明顯。這可能與PG活性受到抑制有關(guān)。

3 結(jié)論

熱解液可以破壞甜瓜炭疽菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使菌絲體中的蛋白質(zhì)、核酸及糖類物質(zhì)外滲，總糖含量降低從而對病菌起到了抑制作用。從甜瓜貯藏過程中果實(shí)硬度、可溶性固形物和可滴定酸含量的變化以及PPO、PG酶活性等生理生化指標(biāo)可知，熱解液對甜瓜具有良好的保鮮作用。證實(shí)了熱解液與醋液一樣具有抑菌及保鮮作用。

熱解液處理能有較好的保鮮效果也可能是熱解液具有較強(qiáng)的抑菌活性，抑制了甜瓜表面腐敗菌的生長，進(jìn)而對甜瓜保鮮起到了良好的作用，在試驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱解液處理的甜瓜腐爛率明顯低于對照組。而且隨著貯藏時間的延長，發(fā)現(xiàn)熱解液濃度大，對甜瓜的保鮮效果越明顯，因此對熱解液的保鮮機(jī)理需要進(jìn)一步探究。