賈東宇　伊松林　何正斌

(北京林業(yè)大學，北京，100083)

沉香是瑞香科白木香屬Aquilariasinensis(Lour.) Gilg植物受到傷害后分泌的產(chǎn)物[1]。林業(yè)行業(yè)標準LY/T 2904—2017《沉香》將其定義為沉香屬樹種在生長過程中形成的由木質部組織及其分泌物共同組成的天然混合物質。沉香以其藥用價值和獨特的芳香氣味遠近馳名，被用于中藥、制香、宗教等領域[2-5]。在東南亞、南亞等國家也稱作Agarwood、Eaglewood、Gaharu、Jinko、Aloeswood、Pokok karas、Kalamabak等[5-6]。

奇楠(也叫棋楠)香味獨特，資源稀缺，是沉香中最名貴、價值最高的品種[7-8]。除奇楠以外的沉香，稱之為普通沉香。普通沉香以其產(chǎn)地不同被分為兩類，即惠安系沉香和星洲系沉香?；莅蚕党料惝a(chǎn)地包括中國、越南、柬埔寨、印度、泰國、老撾、緬甸等；星洲系沉香產(chǎn)區(qū)包括馬拉西亞、印尼和文萊等[9-10]。與星洲系沉香相比，惠安系沉香因其香味更受歡迎，所以售價更高[9-10]。3種沉香同為沉香，但是價格相差甚遠。區(qū)分3種沉香需要豐富的經(jīng)驗，沒有經(jīng)驗的消費者很容易將三者混淆。通常通過人工對奇楠、星洲系沉香和惠安系沉香進行鑒別。人工鑒別的原理是品鑒沉香加熱后釋放出揮發(fā)性有機化合物(VOSs)的味道。由有經(jīng)驗的品香師通過加熱或者點燃沉香(沉香片或者沉香精油)釋放出來的味道進行品鑒區(qū)分。這種方法具有一定的局限性，表現(xiàn)在人工鑒定可能存在的主觀性引入的誤差、可重復性差、耗時，且對品香人員有經(jīng)驗要求[9]。

沉香主要內含物成分為倍半萜(52%)、色酮類物質(41%)和其他芳香化合物[4,11-13]。加熱后釋放出的VOCs主要為倍半萜和其他芳香族化合物。許多倍半萜物質具有獨特的香味，導致沉香香味不同[5,14]。近年來通過GCMS方法對沉香成分的探索和鑒別研究備受學者關注[4-6,10,14-19]。然而，對奇楠、惠安系沉香和星洲系沉香的鑒別鮮有人探尋。本研究通過熱脫附-氣質聯(lián)用法(TD-GCMS)結合逐步回歸法(SR)和Fisher判別分析(FDA)對沉香加熱后釋放的揮發(fā)性有機化合物(VOCs)成分進行分析，目的在于模仿人工方法，實現(xiàn)對奇楠、惠安系沉香和星洲系沉香的鑒別，同時避免由人為主觀因素等引入的鑒定誤差。

1　材料與方法

1.1　材料與樣品制備

本研究共選取58個沉香樣品，其中16個奇楠樣品、27個惠安系沉香樣品和15個星洲系樣品。其中奇楠和惠安系沉香產(chǎn)于中國、越南、印度、泰國、柬埔寨等地，星洲系沉香產(chǎn)于印尼、馬來西亞、文萊、巴布亞新幾內亞、蘇門答臘等地。本研究的所有樣品均由北京沉香協(xié)會提供，并經(jīng)過協(xié)會專家組鑒定分類與實際相符。

本研究針對沉香VOCs的釋放特性，對沉香進行熱處理。全部樣品切成小片狀或者屑狀，經(jīng)過氣干后，磨成40目的沉香粉末。每個沉香樣品取粉末20 mg，分別置于頂空瓶擰緊，用氮氣洗氣，加熱至160 ℃，保溫1 h。通過上述過程，沉香樣品受熱揮發(fā)的VOCs被收集于頂空瓶中。用Tenax管采集沉香VOCs，載氣為氦氣，流速6 mL/min，采集時間為50 min，用于GCMS檢驗。

1.2　設備與參數(shù)

本研究采用TD-GCMS聯(lián)用設備，其中TD設備型號為TD MARKES Series 2；氣相色譜設備型號為Agilent 7890A；質譜設備型號為Agilent 5975C；色譜柱型號為DM 726641A(50 m×320 μm×1 μm;325 ℃)。參數(shù)設置如下：傳輸線溫度180 ℃，解析溫度280 ℃，冷阱溫度-10 ℃，氦氣載氣80 mL/min；離子源溫度230 ℃，質譜掃描范圍35～400。升溫程序：初溫40 ℃，保持1 min；以5 ℃/min的速率升到150 ℃，再以1 ℃/min的速率升到170 ℃，保持3 min；再以1 ℃/min的速率升到180 ℃，保持3 min；再以10 ℃/min的速率升到200 ℃；再以20 ℃/min的速率升到280 ℃，保持1 min。氦氣載氣3 mL/min，不分流。輸出最小峰面積為最大峰面積的1%，選擇NIST14質量標準庫和搜索程序為質譜數(shù)據(jù)庫。取相似度80%及以上的倍半萜及其他簡單芳香化合物成分為分析對象。

1.3　逐步回歸法(SR)

逐步回歸法(SR)是對復雜數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分類之前的一種處理方法[20]。采用有進有出的算法，按照變量是否重要，逐步引入變量，同時考慮較早引入的變量會因新變量的引入喪失重要性，變得不再顯著，此時可以剔除，直至判別式中沒有不重要的變量需要剔除。本研究建立SR模型旨在逐步篩選出特征化學成分。遵循兩個原則：a、每次選擇Λ最小者進入模型。首先選擇Λ最小進入模型，然后重新計算未被選中的其他變量與選中變量的Λ統(tǒng)計量，剩余統(tǒng)計量最小者與已經(jīng)進入模型的變量搭配進入模型。b、當F>Fαin或P<αin時進入，當F≤Fαout或P≥αout時剔除。本研究規(guī)定αin=0.05和αout=0.10。邊進入邊剔除，一步一步以此類推。

1.4　Fisher判別分析法(FDA)

Fisher判別分析(FDA)是一種用來分開兩種或兩種以上的物體或事件的線性組合法[21-22]，是一個經(jīng)典的監(jiān)督學習方法。原理是利用降維的方法找到最好的D-1維平面，將一個D維空間分成兩個或更多子空間，定義為類間方差與類內方差之比[23]。FDA是一種經(jīng)典的有監(jiān)督學習方法，常用于動植物識別領域。本研究以SR篩選出的特征化合物為變量建立FDA模型，可更為精確地判定樣品歸屬。

本研究的數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS19.0 software完成,所有配圖通過OriginPro 9.0 software繪制。

2　結果與分析

2.1　沉香的GCMS檢測成分

對58個沉香樣品進行TD-GCMS分析。經(jīng)分析沉香樣品的VOSs成分共含有175種倍半萜及其他芳香化合物(序號V001-V175)(見表1)。

表1　175種化學成分及其參數(shù)

續(xù)(表1)

續(xù)(表1)

注：CAS號為美國化學會的美國化學文摘服務社化學物質登錄號。

從表1可以看出，175種化學成分中，包含158種倍半萜及17種其他芳香化合物。175種化學成分對應26個相對分子質量，158種倍半萜共享9個相對分子質量。其中相對分子質量190.172、202.172、204.188、218.167、220.183、222.198、234.162均含有多個同分異構體。

表2　3種沉香中倍半萜及其他芳香族化合物組成

結合表1、表2可以看出：

①3種沉香倍半萜成分相對總峰面積高于其他芳香族化合物成分，倍半萜成分種類數(shù)量也高于其他芳香族化合物成分。特別是相對分子質量為204.188、220.183、222.198的相對峰面積和化合物種類都很豐富，說明沉香種含有大量倍半萜，且多以同分異構體形式存在。同分異構體倍半萜可以作為鑒別沉香的重點考查成分。

②3種沉香的倍半萜相對總峰面積中，惠安系沉香最低(31.38%)，奇楠最高(45.89%)；其他芳香族化合物相對峰面積，星洲系沉香最高(15.40%)，另外兩種沉香基本持平。這些相對峰面積差異可以為鑒別3種沉香提供依據(jù)。

③研究表明沉香內含物中，倍半萜約占到52%，在本研究方法及條件下，倍半萜成分檢出率約為61.2%～88.3%。前人研究證明在200 ℃以下時，倍半萜不裂解，因此本研究未檢出的倍半萜可能因為是溫度未達到全部倍半萜成分的沸點。因此，建議若要提高倍半萜檢出率，可以在本研究方法基礎上適當提高試驗溫度。

2.2　逐步回歸分析

175種化合物對于建立判別分析模型及分析模型的應用來說過于繁雜，也會給實際計算和檢測帶來麻煩。SR結合判別分析作為有監(jiān)督分析方法常用于樣本的分類，可以實現(xiàn)給定的樣本類間最大分離[25-26]。本研究采用SR分析作為判別分析的前處理，對175種化合物進行篩選，旨在鎖定數(shù)量較少的特征化合物，用于接下來建立判別模型。

依據(jù)58個樣品對應的175個化合物及其相對峰面積，建立逐步分析模型。分別計算每個化合物的Λ、F和P。再根據(jù)P值剔除成分，邊進入邊剔除，一步一步以此類推。共篩選出34種特征化合物(以X1-X34表示)，其中包含8個相對分子質量(見表3)，即134.073、136.089、202.172、204.188、218.167、220.183、222.198和234.162。其中134.073(C9H10O，4-甲氧基苯乙烯)和136.089(C9H12O，4-乙基苯甲醚)為其他芳香族化合物。其余6個相對分子質量均為倍半萜物質：202.172(C15H22，8個同分異構體)、204.188(C15H24，15個同分異構體)、218.167(C15H22O)、220.183(C15H24O)，222.198(C15H26O，6個同分異構體)和234.162(C15H22O2)。

圖1為3種沉香對應34種特征化合物的相對峰面積，其中橫坐標為34種特征化合物，縱坐標為對應相對峰面積的平均值，奇楠為16個樣品平均相對峰面積，惠安系沉香為27個樣品相對峰面積，星洲系沉香為15個樣品平均相對峰面積。對比3種沉香中的34個特征化合物相對峰面積，可以看出：

①3種沉香特征化合物相對峰面積存在明顯差異，說明34種特征化合物能作為區(qū)分3種沉香的依據(jù)。

②3種沉香的001460-73-7(222.198)、1000374-17-1(204.188)、117066-77-0(222.198)等倍半萜類特征化合物相對峰面積均較高，說明倍半萜在3種沉香內均大量存在。

③3種沉香均含有其他芳香族化合物000637-69-4(C9H10O，4-甲氧基苯乙烯)，其中奇楠中相對峰面積最高，惠安系沉香和星洲系沉香中相對峰面積較低且基本持平。這說明其他芳香族化合物可以作為鑒別奇楠的依據(jù)。

圖1　3種沉香34種特征化合物的相對峰面積

2.3　Fisher判別分析

2.3.1Fisher判別公式及重心坐標計算

對58個沉香樣品及其34種特征化學成分建立模型，分為奇楠(j=1)、惠安系沉香(j=2)和星洲系沉香(j=3)3個總體。

其中，當j=1時，X1代表奇楠，m=16，n=34；當j=2時，X2代表惠安系沉香，m=27，n=34；當j=3時，X3代表星洲系沉香，m=15，n=34。

各類平均值計算公式：

(1)

總均值計算公式：

(2)

特征根數(shù)量=min(j-1,n)=min(2,34)=2，所以該模型具有兩個特征根，以及兩個判別方程。

為了方便計算和應用，本研究選用非標準化判別函數(shù)，其Fisher判別函數(shù)定義為：

y=a′x+c

。

(3)

常數(shù)項計算公式為

(4)

Fisher判別函數(shù)系數(shù)及常數(shù)見表3，代入判別函數(shù)可以得到Fisher判別方程：

Y1=16.136×X1-19.772×X2+2.063×X3-0.431×X4+

187.72×X5+3.029×X6-4.202×X7-2.101×X8-

8.746×X9+7.097×X10+2.684×X11+4.727×X12+

11.256×X13+2.25×X14-2.343×X15+18.535×X16-

5.831×X17-2.597×X18+2.967×X19-210.297×X20-

65.473×X21+7.25×X22-242.104×X23-343.576×

X24+40.152×X25-5.476×X26+38.095×X27-1.703×

X28-1.712×X29-9.024×X30+4.493×X31+245.128×

X32+29.538×X33+1.279×X34-19.197。

(5)

Y2=-0.243×X1-9.84×X2+16.992×X3+0.239×X4+

10.162×X5+4.274×X6+0.178×X7-0.434×X8+

15.494×X9-18.678×X10+0.023×X11+1.456×

X12+0.733×X13-13.19×X14-0.302×X15+6.866×

X16+4.462×X17-0.775×X18+0.177×X19-32.506×

X20-13.481×X21+1.486×X22-21.823×X23+19.683×

X24+30.779×X25+0.974×X26-5.727×X27-6.239×

X28+0.008×X29+1.413×X30+0.243×X31-25.27×

X32+5.729×X33-0.157×X34-4.87。

(6)

其中Y1和Y2分別為Fisher判別方程(公式5和公式6)的值。

值得一提的是，F(xiàn)isher判別模型并未給出分類法，本實施例中選取不加權法計算各組重心。公式為

(7)

同理可計算其他兩組。奇楠的重心坐標D1為(-6.742,8.263)；惠安系沉香的重心坐標D2為(-18.233，-3.930)；星洲系沉香的重心坐標D3為(40.011，-1.739)。

2.3.2Fisher判別模型的評價

λ的方差計算：

λ1的方差=613.032/(613.032+28.268)=95.592%；

λ2的方差=28.268/(613.032+28.268)=4.408%。

Λ統(tǒng)計量的計算：

自由度的計算公式：

dk=(n-k+1)(j-k)。

(8)

d1=(n-k+1)(j-k)=(34-1+1)(3-1)=68；d2=(n-k+1)(j-k)=(34-2+1)(3-2)=33

卡方的計算公式：

(9)

表3　3類沉香Fisher判別函數(shù)系數(shù)、特征化學成分及其CAS號

表4　FDA的特征值

表5　FDA的Λ統(tǒng)計量

圖2　58個沉香樣品的Fisher判別方程值

由表4所述FDA模型的描述可知，判別函數(shù)的特征根為(613.032和28.268)，兩個特征根累計解釋了100%的方差，相關系數(shù)分別為0.999和0.983；表5是Λ統(tǒng)計量，用于描述Fisher判別模型的判別能力，可以看出判別函數(shù)的判別能力顯著(P=0)；圖2是以58個樣品的Fisher判別方程的值(Y1和Y2)作圖，可以看出3種沉香被有效區(qū)分開。這表明該Fisher判別方程效果顯著，該模型適用于奇楠、惠安系沉香和星洲系沉香3種沉香的鑒別。

值得指出的是FDA可以用于對未知樣品的類別鑒別。采用與本研究相同的試驗方法及條件對未知樣品進行試驗，分別計算出34種特征化合物對應的相對峰面積，代入公式5和公式6中，求出未知樣品的坐標(Y1，Y2)，與3種沉香的重心坐標進行比較，距離相近的即為該未知樣品的類別。

3　結論

3種沉香樣本在160 ℃加熱1 h后，均釋放出VOCs，其主要成分為倍半萜和其他芳香族化合物。其中相對分子質量為204.188(C15H24)、220.183(C15H24O)和222.198(C15H26O)的倍半萜在沉香樣本中以同分異構體形式大量存在。

在本研究方法及條件下，倍半萜成分檢出率約為61.2%～88.3%，建議若要提高倍半萜檢出率，可以在本研究方法基礎上適當提高試驗溫度。

對160 ℃熱處理沉香釋放出的VOCs用TD-GCMS結合SR進行分析，可以得到34種特征化合物，這些特征化合物可以用于對奇楠、惠安系沉香和星洲系沉香的鑒別。

用FDA法，可以對奇楠、惠安系沉香和星洲系沉香進行鑒別。研究結果證明FDA對樣品中沉香類別的鑒別切實有效。FDA得到判別方程和重心坐標可以用對與未知沉香的鑒別。具體方法是將未知類別的沉香樣品代入判別方程，其結果與3種沉香的重心坐標進行比較，距離相近的即為該未知樣品的類別。

用TD-GCMS結合SR和FDA對沉香VOCs成分分析，進而鑒別3種沉香的類別是可行的。用該方法可以代替人工分類，可以避免人工測試引入的誤差。