魏佳玉　張素芳　劉紫怡　張海胤　付粱晨　楊樹云　張磊

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約在18～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要參與轉(zhuǎn)錄后水平基因表達的調(diào)控，其結(jié)構(gòu)很保守，所以可以通過生物信息學(xué)的方法來預(yù)測miRNA和其靶基因。自從2002年在擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)中發(fā)現(xiàn)植物中第一個miRNA后[1]，截止到2017年目前為止，曼徹斯特大學(xué)和劍橋大學(xué)組建的miRBase數(shù)據(jù)庫miRBase(18.0)公布了223個物種的28 645條miRNA前體序列，35 828條成熟序列，但是絕大多數(shù)是被子植物，裸子植物只有火炬松(PinustaedaL.)和云杉(Piceaaspoerata)等少數(shù)物種的miRNA信息被收錄[2-3]。裸子植物miRNA信息的匱乏很大程度阻礙了其miRNA的研究進展，高通量測序技術(shù)的運用可幫助解決這個問題，特別對于基因組龐大、ESTs信息少的針葉樹，Solexa測序可高通量、快速、有效的獲取miRNA信息。

長白落葉松作為中國東北地區(qū)重要的經(jīng)濟、生態(tài)及主要的造林樹種之一采用常規(guī)改良的方法獲得的遺傳增益隨著改良周期的增加而降低，而且其遺傳背景較為復(fù)雜，基因組龐大，對其生長發(fā)育等分子機理的研究比較落后，通過對長白落葉松不同發(fā)育時期的形成層樣品的miRNA差異表達分析，找出可能參與調(diào)控長白落葉松生長發(fā)育過程的miRNA，從而為針葉樹種分子育種的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

形成層是木本植物位于木質(zhì)部和韌皮部之間的一種分生組織，向莖的中軸方向分裂而形成新的木質(zhì)部細胞，向外分裂形成新的韌皮部細胞，大量調(diào)控木材合成的基因在此過程中表達，所以本研究以生長在東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實驗林場的長白落葉松無性系的形成層為試驗材料，選取相同無性系材料3株，根據(jù)長白落葉松生長物候期及前期觀測[4-6]，分別于粗生長開始時期(5月5日，S01)和粗生長旺盛期(6月15日，S02)取已木質(zhì)化的側(cè)枝，剝?nèi)淦ぜ绊g皮部，取形成層及周圍組織薄層樣品，立刻置于液氮中，帶回實驗室置于冰箱-80 ℃保存，提取RNA。

采用Nanodrop、Qubit2.0、Agilent2100 bioanalyzer方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性等，保證樣品符合測序要求，樣品檢測合格后，以總RNA為起始樣品，使用small RNA Sample Pre Kit試劑盒提取構(gòu)建small RNA文庫。然后通過Solexa測序技術(shù)快速分離鑒定miRNA，使用miRDeep2軟件鑒定出保守的和新發(fā)現(xiàn)的miRNA。

通過原始測序數(shù)據(jù)處理后對miRNA進行預(yù)測及數(shù)據(jù)分析，采用植物miRNA本地命令軟件TargetFinder預(yù)測miRNA的靶基因。利用blast軟件將預(yù)測靶基因序列與COG、GO、KEGG、SwissPort和NR數(shù)據(jù)庫中的與其相應(yīng)的mRNA序列分別進行比對，從而獲得靶基因的注釋信息。

2　結(jié)果與分析

2.1　miRNA序列結(jié)果分析

構(gòu)建miRNA文庫后，通過質(zhì)量控制，每個樣品的干凈數(shù)據(jù)均大于11.91 M，其中S01從原始數(shù)據(jù)21 095 170中獲得15 294 797分析數(shù)據(jù)，占總數(shù)的72.50%，S02從原始數(shù)據(jù)16 395 342中獲得11 913 982待分析數(shù)據(jù)，占總數(shù)的72.67%。最終共預(yù)測到78個新的miRNA，未得到已知的miRNA，由于Dicer酶和DCL酶的特異性，最終生成的成熟miRNA長度主要集中在20到22個核苷酸的范圍內(nèi)，其中以21個核苷酸居多，占總數(shù)的55.13%。

新預(yù)測的78個miRNA中，差異表達的miRNA為49個，分屬于miR164、miR166、miR160、miR950、miR396這5個miRNA家族，其中16條上調(diào)表達，33條下調(diào)表達。

2.2　差異表達的miRNA分析

2.2.1差異表達的miRNA GO分析

差異表達的miRNA在GO分析中主要分為3個分支：分別是細胞組分(描述基因產(chǎn)物在什么地方起作用)、分子功能(描述在個體分子生物學(xué)上的活性)、生物學(xué)過程(由分子功能有序地組成具有多個步驟的一個過程)。共涉及了23個類別，其中細胞組分8類，分子功能均分6類，生物學(xué)過程分9類(圖1)。

圖1　差異表達miRNA的GO分析

差異表達的miRNA的靶基因注釋總共有315個，占所有靶基因注釋總數(shù)的55.95%。其中，與細胞組分相關(guān)的靶基因有39個，所占比例較多的3個分別是：細胞(8個)、細胞器(8個)、細胞組分(8個)，其他的總共有15個；與分子功能相關(guān)的靶基因有129個，所占比例較多的兩個分別是：催化活性(54個)、綁定(70個)，其它合計5個；與生化過程相關(guān)的靶基因有147個，所占比例較多的3個分別是：代謝過程(38個)、細胞過程(37個)、刺激反應(yīng)(45個)，其它合計共有27個。結(jié)果表明差異miRNA參與了細胞組成、分子功能、生化過程3個方面，為后續(xù)的miRNA基因的功能研究提供參考。

2.2.2差異表達miRNA的COG分析

差異表達miRNA靶基因的COG數(shù)據(jù)庫分類注釋結(jié)果表明(圖2)：所有靶基因涉及到氨基酸、輔酶、脂質(zhì)、無機離子運輸和代謝等運輸代謝過程，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源、細胞壁和細胞膜發(fā)生，轉(zhuǎn)錄，復(fù)制，重組和修復(fù)，轉(zhuǎn)錄后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，分子伴侶等生命過程，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制過程，一般功能預(yù)測和未知功能等功能預(yù)測幾大類別。在不同的功能分類中，注釋到的差異miRNA靶基因反映了對應(yīng)時期和環(huán)境下生理或代謝偏向等信息，結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)錄，復(fù)制，重組和修復(fù)，細胞壁和細胞膜發(fā)生，轉(zhuǎn)錄后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，分子伴侶等生命過程，無機離子運輸和代謝相關(guān)的靶基因表達量相對較高，這說明測序樣品正處于旺盛的生長發(fā)育期，和實際情況樣品處于年生長周期的粗生長初期和旺盛期相符。

圖2　差異表達miRNA靶基因的COG分析

2.2.3差異表達的miRNA KEGG分析

對miRNA靶基因KEGG的注釋結(jié)果按照通路類型進行分類，發(fā)現(xiàn)其參與16個通路類型，分別為(1)核糖體，(2)脂肪酸生物合成，(3)N-Glycan生物合成，(4)植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，(5)Propanoate新陳代謝，(6)內(nèi)吞作用，(7)Butanoate新陳代謝，(8)纈氨酸、亮氨酸、和異亮氨酸的生物合成，(9)在真核生物核糖體生物起源，(10)植物-病原互作，(11)丙酮酸代謝，(12)C5-Branched二元酸新陳代謝，(13)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白處理，(14)泛酸酯和生物合成，(15)剪接體，(16)RNA運輸。說明在長白落葉松生長發(fā)育過程中，可能需要多種代謝途徑共同參與，而這些代謝途徑由多個miRNA的共同協(xié)調(diào)作用完成，而miRNA的靶標的作用機制和原理還有待進一步研究和驗證。

2.2.4差異表達的miRNA靶基因分析

差異表達miRNA層次聚類分析結(jié)果顯示：所有miRNA表達豐度不同，可以分為常規(guī)表達(表達量很低)和高豐度(表達量較高)兩類(圖3)。對同一個miRNA在兩個樣本中的差異表達情況分析，出現(xiàn)差異表達的miRNA(49個)約占所有測序的miRNA(78)的62.82%，差異表達一倍以上的miRNA12個，其中上調(diào)表達的2個，下調(diào)表達的10個，分別占全部上調(diào)表達(16個)和下調(diào)表達(33個)的miRNA12.5%和30.3%(表1)。miRNA負調(diào)控其靶基因，可以推測在粗生長旺盛期時，與木材材性合成的相關(guān)基因大量表達，所以miRNA大多表現(xiàn)為下調(diào)表達。差異表達miRNA層次聚類分析結(jié)果表明(圖3)：差異表達部分大都出現(xiàn)高豐度表達的miRNA中，差異表達的miRNA有一部分是屬于穩(wěn)定表達的，而有部分是隨著生長發(fā)育不斷變化的。

S01表示粗生長開始時間(5月5日)；S02表示粗生長旺盛期(6月15日)。

2.2.5差異表達的miRNA的注釋分析

通過將差異表達的miRNA與數(shù)據(jù)庫中已有序列進行比對發(fā)現(xiàn)，部分miRNA與其它已知植物的miRNA序列相似度較高，如擬南芥，火炬松等(表2)[2,7-14]，將比對到的物種的miRNA序列查找文獻可知其中大部分miRNA處于剛被發(fā)現(xiàn)，功能尚不清楚。在已知功能的miRNA中，發(fā)現(xiàn)擬南芥miR164c通過調(diào)控靶基因影響生長素梯度、側(cè)根的起始以及花瓣的數(shù)量[9]，擬南芥miR396家族在高表達情況下導(dǎo)致擬南芥花柱頭彎曲，擬南芥AtTTP-miR160-ARF17通路參與胼胝質(zhì)合成的調(diào)控等[11]，都對擬南芥的生長發(fā)育有影響，這些結(jié)論將作為長白落葉松miRNA功能初步分析的依據(jù)，從中挖掘可能參與調(diào)控生長發(fā)育的miRNA進行qRT-PCR分析，以進一步判斷及分析這些miRNA在的功能。

表1　差異表達

表2　miRNA序列比對結(jié)果

3　結(jié)論與討論

長白落葉松粗生長初期和盛期樣品中共發(fā)現(xiàn)49個差異表達的miRNA，占全部新預(yù)測的miRNA(78個)的62.82%，分屬于miR164、miR166、miR160、miR950、miR396這5個miRNA家族，其中16條上調(diào)表達，33條下調(diào)表達。GO分析表明這些差異表達的miRNA主要參與了細胞組分、分子功能和生物學(xué)過程中共計23個類別，其中調(diào)控把基因參與最多的主要是催化活性、結(jié)合、代謝、細胞進程和刺激反應(yīng)。COG數(shù)據(jù)庫分類注釋表明所有靶基因涉及氨基酸、輔酶、脂質(zhì)、無機離子運輸和代謝等8類過程。轉(zhuǎn)錄，復(fù)制，重組和修復(fù)、細胞壁和細胞膜發(fā)生、轉(zhuǎn)錄后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，分子伴侶等生命過程、無機離子運輸和代謝得到注釋到的差異miRNA靶基因表達量相對較高，這說明測序樣品正處于旺盛的生長發(fā)育期，和實際情況樣品相符。

本研究新預(yù)測到了多個長白落葉松miRNA，極大地豐富了針葉樹種的信息資源。由于miRNA能夠揭示分子機理，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，可以利用該功能進行基因沉默的研究，使得不利于植物生長及發(fā)育的基因不表達，得到人們所需要的性狀。而落葉松的基因組復(fù)雜，所以在基因組測序方面明顯落后于其他物種。目前，只有日本落葉松有miRNA的相關(guān)研究結(jié)果，共獲得了來自于85個miRNA家族的174個miRNAs[15]。落葉松良種選擇和繁育已開展多年，獲得了較好的效果，但對于落葉松生長發(fā)育的調(diào)控機理研究很少，本研究彌補了該方面的不足，從miRNA角度探討了落葉松生長發(fā)育的分子機理。隨著越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)，將填補人們對其在基因表達調(diào)控中的更多的認識。

雖然木本植物中雖已經(jīng)鑒定出了很多miRNA，但是對其功能研究還尚不足，在不久的將來，對miRNA及其調(diào)控機制的挖掘及與其功能相結(jié)合，miRNA及其靶基因相互作用將會成為木本植物分子遺傳學(xué)研究的熱點。