范紅英

（惠州學院 生命科學學院，廣東 惠州 516007）

禽流感（Avian Influenza，AI），是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的一種禽類急性傳染?。?］.禽流感病毒是一種甲型流感病毒，根據其對禽類發(fā)病情況不同，分為高致病性、中致病性、低致病性三個級別.目前發(fā)現(xiàn)可以直接感染人的禽流感病毒亞型以H5、H7兩種亞型比較普遍，由這兩種亞型引起的疫情嚴重危害了家禽養(yǎng)殖業(yè).水禽是AIV的天然宿主，也是禽流感病毒的天然貯藏庫，幾乎所有亞型的禽流感病毒都可以在水禽中分離到［2］.世界衛(wèi)生組織將高致病性禽流感列為A類動物疫病，我國也將其列為一類動物疫?。?］.血凝試驗（HA）與血凝抑制試驗（HI）作為檢測部門常用的檢測方法，是檢測血清抗體水平的技術之一［4-5］，但在實際應用中容易受到一些因素的干擾，包括試驗的環(huán)境溫度、抗原-抗體的作用時間、稀釋液PBS的pH等等外界的影響因素［6-9］等.研究發(fā)現(xiàn)，試驗環(huán)境溫度較高應用血凝抑制試驗檢測出禽流感的抗體效價相對較高，稀釋液PBS的pH過高或者過低都會對試驗檢測抗體效價造成影響.抗體的效價隨著抗原-抗體的作用時間的增加而增高［10］.除此之外，血清中的非特異性凝集因子也對水禽類病毒檢測影響較大，造成的錯判率達30%以上［8，11-12］.通過紅細胞吸附法［13］、鴨血球直接測定法、生物化學試劑去除法［14］進行血凝抑制試驗，均有明顯去除非特異性凝集因子的效果.

我國地域寬廣，水系豐富，尤其是珠三角地區(qū)水禽養(yǎng)殖業(yè)最為發(fā)達，采用血凝試驗和血凝抑制試驗快速、準確、簡便的檢測抗體水平，對禽流感的預防監(jiān)測工作非常重要.研究通過對影響鴨血清中H5亞型禽流感病毒血凝與血凝抑制試驗的因素分析，目的是在檢測鴨血清禽流感病毒抗體時，能夠降低非特異凝集現(xiàn)象，提高檢測結果的準確性，因此對鴨禽流感病毒抗體水平的監(jiān)測工作具有非常重要的現(xiàn)實意義.

1　材料與方法

1.1　實驗材料

16份禽流感H5亞型陽性鴨血清（已經注射過H5亞型禽流感疫苗），均采自惠州市某鴨養(yǎng)殖場.

1.2　鴨血清處理

1.2.1鴨血清的抽取

采用翅下靜脈采血，從鴨場中選取16個樣本，每樣本抽取5 mL新鮮鴨血，1000 r/min離心4 min后，抽取上清液于16個Eppendorf管中.

1.2.2鴨血清的分裝和保存

將抽取的每份鴨血清樣本平均分裝在3個Eppendorf管中，并且保存于4℃，待檢.

1.2.3用雞紅細胞泥吸附法處理鴨血清

從冰箱中取出16份不同的鴨血清，一段時間后，讓鴨血清完全解凍.按照紅細胞泥和血清1：20的比例，加入紅細胞泥后，靜置30 min，1200 r/min離心10 min，抽取出上清液于Eppendorf管中，待檢.

1.2.4鴨血清滅活處理

從冰箱中取出16份不同的鴨血清，一段時間后，讓鴨血清完全解凍.將血清置于56℃的水浴鍋中，水浴30 min，冷卻至室溫，待檢.

1.3　血凝與血凝抑制試驗

1.3.1測定抗原效價

按照技術規(guī)范GDFB249-2004微量血液凝集試驗（HA）方法進行測定.

1.3.2抗原工作濃度的配制

用PBS配制4個血凝單位的抗原濃度作為工作濃度（4個血凝單位抗原濃度=抗原效價×4）.

1.3.3回歸試驗（校正實驗）

抗原換為配制好的4個血凝單位抗原，按照技術規(guī)范GDFB249-2004微量血液凝集試驗（HA）方法進行.若第1、2、3孔的紅細胞完全凝集，第4孔的紅細胞開始出現(xiàn)沉淀，第五孔紅細胞的完全沉淀，如果出現(xiàn)以上結果，則表明所配4個血凝單位的抗原濃度準確.

1.3.4抗體效價測定

依照技術規(guī)范GDFB249-2004進行血凝抑制試驗.血凝抑制試驗分3個試驗組：第1組待檢血清為未經處理的鴨血清；第2組待檢血清為用雞紅細胞泥吸附方法處理的血清；第3組待檢血清為滅活的血清.

出現(xiàn)完全抑制紅細胞凝集的血清最大稀釋度倍數M，用log2M值來表示為被檢血清中的抗體效價.判定結果時將微量板做45°豎立，當反應板中孔底部的紅細胞無法流淚似地流下時，立即判定被檢血清抗體效價.記錄經過滅活、用紅細胞吸附處理和未經處理在不同試驗環(huán)境溫度下被檢血清的抗體效價和祛除非特異性凝集因子的情況，并列表比較.

1.5　數據處理

使用SPSS Statistics v20.0軟件對數據進行相關分析、方差分析和樣品配對t檢驗.相關性判斷標準：R＞0表示正相關，R＜0表示負相關；差異顯著性判斷標準為：P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著.

2　結果與分析

2.1　鴨血清中非特異性凝集因子祛除效果

由表1可知，用紅細胞泥處理鴨血請后的檢測試驗中，非特異性凝集現(xiàn)象明顯減少，高濃度和低濃度血清試驗中均沒有發(fā)現(xiàn)非特異性凝集現(xiàn)象，說明此法對鴨血清中非特異性凝集因子的祛除效果非常好.然而在血清不做任何處理和血清滅活處理兩個條件下，每個高濃度血清樣品在3個試驗溫度都出現(xiàn)了非特異性凝集現(xiàn)象.以血清不做任何處理條件下的非特異性凝集更加明顯，每個樣品平均有1.5個以上的孔出現(xiàn)了非特異性凝集現(xiàn)象.

在低濃度血清滅活后的檢測中，3個試驗溫度下都沒有出現(xiàn)非特異性凝集現(xiàn)象.相對于對照組，血清滅活再進行血凝抑制試驗檢測H5亞型禽流感病毒抗體時，非特異性凝集現(xiàn)象減少，低濃度血清下幾乎沒有非特異性凝集.雖然高濃度血清下，非特異性凝集依然存在，但對檢測結果的判定不造成影響.由此可以說明血清用紅細胞泥處理和滅活處理后進行血凝抑制試驗檢測H5亞型禽流感病毒抗體時，檢測結果的判定不會受到非特異性凝集現(xiàn)象的干擾.但是，這兩種處理方法是否會影響結果準確性，需要對結果進一步進行生物統(tǒng)計學分析.

表1　不同處理下非特異性凝集的祛除效果

2.2　血凝抑制試驗檢測結果的生物統(tǒng)計學分析

對血凝抑制試驗檢測出的抗體效價采用生物統(tǒng)計學分析.對16個樣品在3個不同試驗溫度下的檢測結果采用SPSS進行相關分析，見表2.結果顯示，不同的血清處理方法，檢測出的抗體效價和試驗溫度的相關系數都為正數，說明試驗溫度和檢測出的抗體效價呈正相關關系，即試驗溫度越高，檢測出的抗體效價越高.可見，試驗溫度會對檢測結果造成影響.這種影響顯不顯著，則需要再進一步進行分析.

表2　3個不同試驗溫度下檢測結果的相關性分析

由于禽類體內的抗體水平是固定的，不同條件下的檢測可能會有不同的誤差，對所檢測的抗體效價影響越不顯著，說明檢測出來的結果越準確.采用SPSS對檢測出的鴨血清中H5禽流感病毒抗體效價進行方差分析，結果如表3所示.可以看出，試驗環(huán)境溫度對所檢測抗體效價的影響極顯著（P＜0.01），說明試驗環(huán)境溫度的改變會嚴重影響抗體的效價.表3中還顯示，試驗環(huán)境溫度與血清處理的方法之間的互相作用對所檢測的抗體效價的影響達到了極顯著的水平（P＜0.01），說明試驗環(huán)境溫度的改變和血清處理方法的共同作用對檢測出的抗體效價影響也很大.然而，血清的處理方法對抗體效價的影響則不太顯著（P≈0.05），說明血清的處理方法對檢測結果存在影響，但不是十分明顯.因此，在實際的檢測中，應該注意用血清的處理方法來選擇控制合適的試驗環(huán)境溫度.

表3　鴨血清中H5禽流感病毒抗體效價的方差分析

目前，由農業(yè)部行業(yè)標準NY/T7692004可知，血凝試驗的環(huán)境為25℃，即為室溫條件下，檢測出的抗原效價的準確性較高，禽流感抗體水平的評判標準也是在試驗環(huán)境溫度為25℃的條件下制定的.所以，技術規(guī)范GDFB249-2004中的規(guī)定，檢測禽流感抗體效價在室溫下，血清不做任何處理進行檢測.本研究采取了不同試驗環(huán)境溫度和對血清不同處理方法進行血凝抑制試驗對鴨血清H5亞型禽流感病毒抗體進行檢測，改變了規(guī)定的條件，則需要對其檢測結果的準確性進行判斷.因此，采用SPSS對檢測結果分別與試驗溫度為25℃血清不做任何處理進行配對樣本t檢驗對比，見表4.

由表4可見，血清滅活處理在3種試驗環(huán)境溫度下，與25℃下血清不做任何處理的檢測結果差異性不顯著（P＞0.05），說明血清滅活處理在3種試驗環(huán)境溫度下對血凝抑制試驗所檢測出來的抗體效價的準確性影響很小，這些條件在進行鴨血清的血凝抑制試驗中均可采用.因此，可以對血清滅活后再進行血凝抑制試驗檢測H5亞型禽流感病毒抗體水平.

然而，4℃下血清用紅細胞泥處理與25℃下血清不做任何處理的結果差異顯著（P＜0.05），25℃、37℃下血清用紅細胞泥處理與25℃下血清不作任何處理的結果為極顯著水平（P=0.01）.由此可見，用紅細胞泥吸附血清后檢測出的抗體效價和25℃下血清不做任何處理檢測出的抗體效價的差異性很大，這種處理方法會對檢測結果的準確性造成影響.因此，在實際進行檢測時，為了確保檢測結果的準確性，不建議采用紅細胞泥吸附血清處理后再進行檢測.

表4　血清滅活處理和紅細胞泥吸附處理與對照結果的t檢驗

3　結論與討論

鴨血清中H5亞型禽流感病毒抗體檢測進行的血凝試驗是依據在試驗中雞的紅細胞發(fā)生凝集作用，但是會被鴨血清中抗體所抑制而沉淀下去，通過抑制的情況大小來判定被檢血清中抗體的效價［15-16］.然而，水禽的血清中通常含有一種或者多種非特異性凝集因子，當被檢的水禽動物血清中非特異性凝集因子存在時，將會影響雞紅細胞在血凝抑制中凝集，直接影響動物檢驗檢疫的準確性和權威性，給國內外動物貿易和疫病的預防帶來不良影響［17-18］.

本研究采用了3種不同的試驗溫度和2種不同的血清處理方法，結果發(fā)現(xiàn)，2種血清不同的處理中，血清滅活處理后，鴨血清中的非特異性凝集因子有所減少，在低濃度血清下進行檢測，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)非特異性凝集現(xiàn)象.雖然在高濃度血清下，非特異性凝集依然存在，但是這對結果的判定不會造成影響.說明滅活血清后，可以減少一些非特性因子，降低在檢測工作中的誤判.用紅細胞泥吸附處理后，對鴨血清中的特異性凝集因子祛除效果非常好，高濃度的血清下進行檢測，也沒有發(fā)現(xiàn)有非特異性凝集反應.但是，用紅細胞泥吸附后再進行檢測，3個不同試驗溫度下的檢測結果與25℃下血清不做任何處理的結果都有顯著性差異，甚至極顯著差異.因此，在確保檢測結果的前提下，對于紅細胞泥處理鴨血清這種方法是否能夠真正在檢測中推廣，仍需進一步深入研究完善.

本次研究還發(fā)現(xiàn)，在高的試驗溫度和低的試驗溫度下，非特異性凝集因子引起的凝集反應較少，可以減少檢測中非特異凝集引起的誤判.但是，試驗環(huán)境溫度對抗體效價的影響極顯著（P＜0.01），環(huán)境溫度對檢測的結果影響比較大.根據相關研究發(fā)現(xiàn)，血凝抑制試驗檢測出的抗體效價跟試驗環(huán)境溫度有關，試驗環(huán)境溫度越高，所測出的效價越高［11］.而且，當溫度過低，出結果慢，溫度過高，出結果過快［5］.影響結果的判斷，從而影響準確性.并且，在實際檢測中，25℃就是室溫溫度，操作上比較方便控制，在一些基礎條件比較落后的獸醫(yī)站和沒有恒溫箱下都可以進行檢測.因此，試驗環(huán)境溫度為25℃是比較合適的溫度.

雖然用紅細胞泥吸附后對非特異性凝集因子的祛除效果最好，但是檢測出抗體效價不準確.而血清滅活處理后對抗體的效價不會造成影響，與25℃下血清不做任何處理檢測出的結果差異不大.所以，試驗環(huán)境溫度為25℃下且血清滅活后，可以作為進行鴨血清血凝抑制試驗的合適條件，該條件下檢測出的抗體效價跟不做處理檢測出的結果相比較，兩者差異性不顯著（P＞0.05），檢測出來的結果具有可靠性.

因此，在實際檢測中，可以先對血清進行滅活處理后，再在25℃的環(huán)境溫度下進行抗體水平的檢測，能夠正確的對禽流感病毒抗體水平進行準確地監(jiān)控，且血清的滅活操作簡單、時間短，對于條件較差的獸醫(yī)站也可以實現(xiàn).因此，這種方法對監(jiān)測鴨血清H5亞型禽流感病毒抗體水平具有重要的現(xiàn)實意義和實用價值，可為檢測部門提供參考，對其他水禽的H5亞型禽流感病毒抗體水平檢測也具有重要意義［19］.