翟莉芳，劉戰(zhàn)花

（惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，廣東 惠州 516008）

隨著現(xiàn)在生活水平的逐漸提高，動物源性食品在人們?nèi)粘ｏ嬍辰Y(jié)構(gòu)中所占比例逐步增大，需求量也逐漸增大.但是因為獸藥（含藥物飼料添加劑）在畜禽產(chǎn)品中的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致動物源性食品中的獸藥殘留的問題引起了人們的熱切關(guān)注的社會焦點［1］.為保證動物源性食品的衛(wèi)生安全，我國已于2002年頒布法規(guī)在畜禽養(yǎng)殖中禁限用多種藥物［2］，但至今這類藥物違法添加事件仍屢禁不止.

國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法對動物源性食品的檢測多局限于單一種類，如動物源性食品中β-受體激動劑［3］、動物源性食品中氟喹諾酮［4］、動物源性食品中磺胺類藥物［5］. 不能夠通過一次前處理，檢測多種類的獸藥殘留，本實驗通過一次前處理，能完成β-受體激動劑、氟喹諾酮、磺胺類藥物的同時檢測，節(jié)約了大量的檢測分析時間.而且使用了新型的強(qiáng)效除脂型Oasis PRiME HLB固相萃取柱，能將動物源性食品中含有的大量脂肪、蛋白質(zhì)、磷酸酯等雜質(zhì)去除，不僅節(jié)約的檢測成本，還提高了檢測效率.

獸藥殘留檢測常用的方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）［6-7］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）［8］、液相色譜法［9-10］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）［11］等.ELISA法雖然快速、方便，但在實際運(yùn)用中假陽性率較高，不能實現(xiàn)在線檢測；GC-MS在檢測時需進(jìn)行衍生，且前處理較繁瑣；LC-MS/MS以其特異性強(qiáng)、高靈敏度，成為了現(xiàn)階段獸藥殘留檢測的首選方法.本研究只通過簡單的提取后，固相萃取法對樣品進(jìn)行前處理，通過高選擇性的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）對處理后的樣品進(jìn)行測定，研制出了UPLCMS/MS快速測定動物源性食品中多種獸藥殘留的方法，為今后多殘留檢測方面的研究提供必要的技術(shù)支持.

1　實驗部分

1.1　儀器、試劑與材料

主要儀器：UPLC-MS/MS 6460超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（金壇市精達(dá)儀器制造廠）；MS3渦旋振蕩器（德國IKA公司）；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；N-EVAP TM 111恒溫水浴氮吹儀（JNC公司）；BS224S電子天平：感量0.1 mg（德國賽多利斯公司）.

主要試劑與材料：乙腈、甲醇：色譜純（德國Merck公司）；甲酸、乙酸銨：分析純（天津市廣成化學(xué)試劑有限公司）；固相萃取柱：Oasis PRiME HLB（60 mg 3 cc，Waters公司）微孔濾膜：0.22 μm（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；25種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr.Ehrenstorfer，純度均大于95%.

標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確稱取適量25種標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別溶解成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液.

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL的各種標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度.

1.2　儀器條件

1.2.1色譜條件

UPLC-MS/MS：色譜柱：C18，100 mm×2.1 mm，1.8 μm；柱箱溫度：40 ℃；進(jìn)樣體積：8 μL；流動相：A相：0.2%甲酸水溶液（含5 mmoL/L乙酸銨），B相：0.2%甲酸甲醇；梯度洗脫程序：見表1.

表1　UPLC-MS/MS梯度洗脫程序

（續(xù)表1）

UPLC-MS/MS：離子源：ESI，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），正離子模式；干燥器溫度：280℃；干燥器流量：9 L/min；霧化氣：40 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；20種獸藥質(zhì)譜測定的離子對、碰撞能量及保留時間如表2所示.按該質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測.

表2　25種獸藥的保留時間、離子對、裂解電壓和碰撞電壓

（續(xù)表2）

1.3　前處理方法

稱取2.5 g組織勻漿樣于50 mL塑料離心管，加入10.0 mL 0.2%甲酸乙腈水溶液（8：2），渦旋混合30 s，置于搖床上30 min，在10000 r/min下離心5 min，取上清液通過Oasis PRiME HLB固相萃取柱，收集濾液約2 mL，過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS測定.

2　結(jié)果與討論

2.1　色譜行為

圖1　UPU圖1.UPLC-MS/MS中25種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流程圖

2.2　凈化條件的確定

對于動物源性食品，傳統(tǒng)的凈化方法是使用正己烷去除脂類，但不能將動物源性食品中的蛋白質(zhì)及磷脂除去，仍需要進(jìn)一步凈化.也有使用C18、MCX、SCX等固相萃取柱對樣品溶液進(jìn)行凈化，但需要對萃取柱進(jìn)行活化、上樣、淋洗、洗脫等過程，步驟多，耗時長，也消耗大量的溶劑.本實驗采用了Oasis PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行簡單、快速的凈化，省去了活化、淋洗、洗脫等過程，還能有效的去除動物源性食品中脂肪、磷脂和蛋白質(zhì).研究還表明Oasis PRiME HLB小柱對25種獸藥吸附很少，過柱前后，25種獸藥的響應(yīng)值變化不大，Oasis PRiME HLB固相萃取對樣品中目標(biāo)物造成的損失很小.

2.3　提取劑的選擇

由于選用了特殊填料的Oasis PRiME HLB固相萃取柱對樣品進(jìn)行凈化，省去了有機(jī)溶劑洗脫的過程，為了保證凈化液能直接用于UPLC-MS/MS檢測，因此選用了有機(jī)溶劑與水的混合溶液對樣品進(jìn)行提取.乙腈作為萬能提取劑，常和甲酸等溶劑混合，配置成酸性乙腈被用于動物源性食品中提取獸藥殘留.但純乙腈不利于雜質(zhì)的去除，也不適用于儀器檢測.而加入一定比例的水，不僅有利于從樣品中提取目標(biāo)物，還有利于減慢過柱速度，使雜質(zhì)更好的被去除，使凈化液更適用于儀器直接檢測.因此，本實驗比較了0.1%甲酸的乙腈水溶液（9：1）、0.1%甲酸的乙腈水溶液（8：2）、0.1%甲酸的乙腈水溶液（7：3）、0.2%甲酸的乙腈水溶液（9：1）、0.2%甲酸的乙腈水溶液（8：2）、0.2%甲酸的乙腈水溶液（7：3）等6種提取劑的提取效率.結(jié)果表明，當(dāng)乙腈與水的比例為9：1時，儀器檢測是目標(biāo)峰出現(xiàn)拖尾.當(dāng)乙腈與水的比例為7：3時，提取效果較差，添加回收率較低.0.2%甲酸的乙腈水溶液（8：2）不僅能很好的從樣品中提取目標(biāo)物，還能較好的去除雜質(zhì)的干擾，且目標(biāo)峰不會出現(xiàn)拖尾，更適合儀器檢測.因此本實驗選擇了0.2%甲酸的乙腈水溶液（8：2）作為提取劑.

2.4　基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限、定量限、回收率及精密度

為降低基質(zhì)效應(yīng)影響，保證檢測結(jié)果可靠準(zhǔn)確，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量. 分別取20 μL、40 μL、80 μL、160 μL、320 μL獸藥標(biāo)準(zhǔn)工作液，在50℃水浴下氮吹至干，加入1.0 mL對應(yīng)基質(zhì)空白溶液定容，渦旋混勻后，按照上述儀器條件進(jìn)行測定，以外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.25種獸藥的線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.996，表明25種獸藥分別在濃度為20.0 ng/mL～320 ng/mL之間有良好的線性關(guān)系.

以3倍信噪比（S/N=3）為方法檢出限（Limit of Detection，LOD），以10倍信噪比（S/N=10）為定量限（Limit of Quantification，LOQ），25種獸藥的檢出限為0.006 μg/kg～0.08 μg/kg，定量限為0.02 μg/kg～0.26 μg/kg.25種獸藥的相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見表3.

在豬肉、豬肝、雞肉樣品中分別添加0.030、0.30 mg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述前處理方法進(jìn)行處理，平行測定6次，得到平均回收率及精密度，各獸藥的平均回收率為70.4%～90.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為5.3%～12.3%，結(jié)果見表4.

表3　25種獸藥的相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

表4　精密度與回收試驗結(jié)果（n=6）

2.5　實際樣品測定

按實驗方法對50批次的豬肉、豬肝、雞肉樣品進(jìn)行測定，其中在一個批次的豬肝中檢測5.7μg/kg的磺胺二甲氧嘧啶，在一個批次雞肉樣品中檢測1.2μg/kg的恩諾沙星，均未超出國家限定范圍，均為合格樣品.

3　總結(jié)

本實驗研究采用酸性乙腈水溶液對動物源性食品進(jìn)行提取，Oasis PRiME HLB固相萃取柱對樣品進(jìn)行簡單、快速的凈化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時快速測定動物源性食品中25種獸藥殘留量的方法.25種獸藥的回收率為70.4%～90.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.3%～12.3%，檢出限為0.006～0.08 μg/kg.該方法簡單、快速、準(zhǔn)確靈敏等特點，適用于動物源性食品中多種獸藥殘留量的測定.