符靖雯，吳育彬，劉惠茹*，楊欽沾

（1.惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，廣東 惠州 516008；2.惠州學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，廣東 惠州 516007）

氟喹諾酮類藥物是一種廣譜抗菌藥物，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、衣原體等均有效.由于其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、生物利用度好、口服安全有效、便宜等優(yōu)點(diǎn)，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用，且使用量巨大［1］，但是細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生的耐藥性已成為全球面臨的巨大挑戰(zhàn).一方面，氟喹諾酮類藥物可直接對(duì)人體健康造成危害.過多使用造成的不良反應(yīng)有許多，比如：引起未成年動(dòng)物關(guān)節(jié)組織中軟骨損失；引起消化系統(tǒng)不良反應(yīng)（惡心、嘔吐、腹瀉等）；造成血液系統(tǒng)中血細(xì)胞及血小板減少；肝臟毒化反應(yīng)等［2］.另一方面，氟喹諾酮類藥物通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境中，由于其溶解性較差，性質(zhì)穩(wěn)定，故在水環(huán)境和土壤中的殘留可以不斷累積，導(dǎo)致氟喹諾酮類藥物在水環(huán)境和土壤中的濃度水平不斷升高，對(duì)水環(huán)境和土壤中的生物造成直接的影響，也對(duì)水環(huán)境和土壤中微生物群落分布結(jié)構(gòu)造成破壞［3］.因此，對(duì)于氟喹諾酮類藥物的殘留檢測(cè)是十分必要的［4-8］.

目前，淤泥中廣譜抗菌藥物殘留的檢測(cè)技術(shù)有毛細(xì)管電泳分析技術(shù)［6］，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［7］，液相色譜法［8］和高效液相色譜-質(zhì)譜［9］等.毛細(xì)管電泳技術(shù)具有高效、快速、進(jìn)樣量少、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是其進(jìn)樣量少，因而制備能力差，光路短，靈敏度低，重現(xiàn)性差等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合使用可檢測(cè)的物質(zhì)種類多，應(yīng)用范圍廣，分辯能力高，但對(duì)混合物的檢測(cè)性能較差；液相色譜分離效率高，選擇性好，檢測(cè)靈敏度高，操作自動(dòng)化，應(yīng)用范圍廣，但分析時(shí)間一般比較長(zhǎng)，若與質(zhì)譜聯(lián)用，可以顯著地提高其靈敏度和精確度，縮短分析時(shí)間，因此，本研究借助串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）高選擇性、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)過較為簡(jiǎn)單的前處理凈化后，可以對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行篩查分析，從技術(shù)原理上杜絕了樣品假陽(yáng)性和假陰性的現(xiàn)象，顯著提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度；同時(shí)基于UPLC-MS/MS方法，可獲得更低的檢出限，能檢測(cè)出0.02 μg/kg的藥物殘留.本論文旨在建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定淤泥中4種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)方法，對(duì)于其在淤泥中的檢測(cè)具有一定的實(shí)用價(jià)值.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器與試劑

超高效液相色譜-三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；高速冷凍離心機(jī)，TGL-16M型，最大轉(zhuǎn)速不低于8000 r/min，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；恒溫水浴氮吹儀，LB-W型，美國(guó)Organomation N-EVAP公司；Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL，美國(guó)Waters公司）；SAX固相萃取柱（3 mL，500 mg，美國(guó)Waters公司）.

氧氟沙星（FOL）、環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）、達(dá)氟沙星（DAN），純度≥98.0%，均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司.甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲酸、乙酸銨（色譜純，廣州化學(xué)試劑廠）；試驗(yàn)用水為超純水.

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取4種氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品至燒杯中，用甲醇溶解，容量瓶中定容，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液.標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于-18℃下避光保存，保存期為6個(gè)月.

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于容量瓶中，用甲醇稀釋成濃度為1.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于4℃下避光保存，保存期為1個(gè)月.

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白樣品提取液稀釋成不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配.

1.2　儀器條件

1.2.1色譜條件

色譜柱：C18柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：8 μL；流速：0.4 mL/min；流動(dòng)相：A相：0.2%甲酸水溶液（5 mmoL/L乙酸銨），B相：0.2%甲酸甲醇溶液.梯度洗脫程序見表1.

表1　流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.2質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離（ESI）；

掃描方式：正離子掃描；

干燥器流速：10 L/min；

噴霧器：50 psi；

干燥器溫度：350℃；

毛細(xì)管電壓：4000 V；

碰撞氣：氬氣，純度≥99.999%；

檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM.化合物的保留時(shí)間、離子對(duì)、裂解電壓、碰撞能量和掃描模式信息參見表2.

表2　優(yōu)化后的4種喹諾酮類抗生素質(zhì)譜參數(shù)

1.3　樣品采集與前處理

采集養(yǎng)殖場(chǎng)的淤泥樣品充分混勻，風(fēng)干去除雜物，研磨過250 μm孔徑篩，充分混勻，取500 g裝入棕色或深色密封瓶中備用.在制樣過程中需防止樣品受到污染或殘留物含量發(fā)生變化，在-18℃保存.

稱取適量的經(jīng)研磨的淤泥樣品于離心管中，加入0.4 g乙二胺四乙酸二鈉鹽（Na2EDTA·2H2O）及10 mL乙腈-磷酸鹽緩沖溶液（1：1）（pH=3）提取液.于搖床振搖后超聲提取，8000 r/min離心5 min，收集上清液.重復(fù)提取2次，合并上清液.在50℃下蒸發(fā)至剩余約10 mL，加水稀釋至約30 mL，備用.

將SAX萃取柱連接在HLB萃取柱頂部，加樣前先后用6 mL甲醇、6 mL水活化柱子，將樣品提取液全部轉(zhuǎn)移至凈化柱，控制流速為1 mL/min.加樣后用6 mL水淋洗固相萃取柱，繼續(xù)抽真空5 min.卸下SAX柱，用5.0 mL甲醇洗脫HLB柱，收集流出液，氮吹至近干，加入定容液，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，上機(jī)待測(cè).

2　結(jié)果與討論

2.1　色譜條件的選擇

考慮到離子掃描模式為ESI+，4種氟喹諾酮類藥物均為兩性化合物，在水溶液里容易發(fā)生解離，形成帶有電子的氟喹諾酮類離子，根據(jù)相似相容原理，故在流動(dòng)相中加入一定的甲酸和乙酸銨加強(qiáng)電離效率，提高分離效果，改善峰形對(duì)稱性.參考已有文獻(xiàn)［10］，在流動(dòng)相中加入0.2%甲酸時(shí)，目標(biāo)化合物的峰形尖銳.同時(shí)在流動(dòng)相中加入乙酸銨緩沖鹽，增加目標(biāo)物的響應(yīng)值，從而提高靈敏度.實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的乙酸銨緩沖鹽對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)值的影響，結(jié)果顯示，在流動(dòng)相中加入乙酸銨后，目標(biāo)物的響應(yīng)值明顯提高，當(dāng)乙酸銨濃度提高到10 mmol/L時(shí)，響應(yīng)值與5 mmol/L時(shí)并無(wú)明顯差異.因此，為了保護(hù)色譜系統(tǒng)，選擇在流動(dòng)相中加入5 mmol/L乙酸銨.

圖1　不同濃度乙酸銨緩沖鹽對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)值

2.2　提取劑的選擇

氟喹諾酮類藥物的極性結(jié)構(gòu)決定了其易與金屬離子發(fā)生螯合，而添加Na2EDTA可有效地抑制藥物與金屬離子螯合從而提高提取率.綜合考慮了4種喹諾酮類藥物的pKa，本實(shí)驗(yàn)分別用乙腈：磷酸鹽緩沖液（1：1）（pH=3）、加入Na2EDTA的乙腈：磷酸鹽緩沖液（1：1）（pH=3）作為提取液，提取加標(biāo)淤泥.結(jié)果如圖2所示，加入Na2EDTA后藥物的回收率得到明顯提高，因此本實(shí)驗(yàn)采用加入Na2EDTA的乙腈：磷酸鹽緩沖液（1：1）（pH=3）作為提取液，回收率在74.2%～88.6%之間.

圖2　有無(wú)加入Na2EDTA的提取劑對(duì)氟喹諾酮類藥物回收率的影響

2.3　稀釋對(duì)回收率的影響

提取液中含有大量極性的有機(jī)溶劑，若使用以聚合物為填料的HLB柱直接進(jìn)行凈化，目標(biāo)物會(huì)被有機(jī)溶劑帶出而無(wú)法保留在SPE柱上，可以通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或者用弱極性溶劑稀釋后降低有機(jī)溶劑的含量，從而提高回收率.本實(shí)驗(yàn)將提取液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約10 mL后，加水至約30 mL，用于凈化.凈化液中乙腈的含量低于3%，由圖3可見，目標(biāo)物的回收率明顯提高.

圖3　稀釋對(duì)淤泥中抗生素回收率的影響

2.4　固相萃取柱的選擇

淤泥中以陰離子形式存在的大量腐蝕酸類有機(jī)質(zhì)對(duì)色譜柱和質(zhì)譜檢測(cè)器有很大影響，因此需要強(qiáng)陰離子交換柱SAX去除這些腐蝕酸性物質(zhì)的干擾.本實(shí)驗(yàn)比較了SPE C18固相萃取柱和Oasis HLB柱對(duì)4種氟喹諾酮類藥物的萃取效率.結(jié)果如圖4所示，以聚合物為填料的HLB柱對(duì)藥物的回收率均高于硅膠鍵合的C18柱.因此，選擇了SAX柱與HLB柱串聯(lián)，不僅能有效的去除土壤中的干擾物質(zhì)，還能很好的富集淤泥中殘留的氟喹諾酮類藥物.

圖4　兩種固相萃取柱對(duì)氟喹諾酮類藥物回收率的影響

2.5　線性范圍和檢出限

本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法進(jìn)行定量.4種氟喹諾酮類藥物的線性范圍、回歸方程以及線性相關(guān)系數(shù)（R2）見表3.結(jié)果表明各藥物在5ng/mL～100 ng/mL線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998.以3倍信噪比（S/N=3）作為方法的檢出限（LOD），4種氟喹諾酮類藥物的檢出限為0.015～0.060μg/kg.

表3　4種喹諾酮類藥物的線性范圍、回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.6　方法回收率和精密度

實(shí)驗(yàn)通過土壤空白樣品添加實(shí)驗(yàn)測(cè)定回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD.當(dāng)添加濃度分別為5 ng/mL、20 ng/mL和50 ng/mL時(shí)，4種氟喹諾酮類藥物的平均回收率為70.4%～89.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.4%～9.4%.4種氟喹諾酮類藥物均能達(dá)到比較滿意的回收率，該方法能夠滿足痕量檢測(cè)的要求.

表4　4種喹諾酮類藥物加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7　實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)從養(yǎng)殖場(chǎng)采集的淤泥樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，4種氟喹諾酮類藥物均無(wú)檢出.

3　結(jié)論

建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）測(cè)定淤泥中4種氟喹諾酮類藥物殘留量.該方法簡(jiǎn)單、快速，靈敏度高，能滿足養(yǎng)殖場(chǎng)淤泥中痕量抗生素殘留檢測(cè).