戴研平，王平，高曉勤

（1.貴州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴州 貴陽 550004；2.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校，貴州 遵義 563006）

砷是一種廣泛存在于自然界的類金屬元素和人類致癌物[1]。研究表明，慢性砷暴露可影響人類的生殖和發(fā)育，但目前關(guān)于砷致癌及生殖毒性的具體機制尚不明確[2-4]。血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）及其受體2（vascular endothelial growth factor recepector 2,VEGFR2）與精子的發(fā)生和成熟有關(guān)。目前尚未見砷中毒及VEGF、VEGFR2與男性不育相關(guān)性的報道。本實驗通過研究VEGF、VEGFR2在慢性砷中毒大鼠睪丸中的表達變化，檢測生精上皮細胞凋亡情況，探討慢性砷中毒對大鼠睪丸損傷的機制，為慢性砷中毒不育的防治提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實驗動物

選擇體重160～200 g健康清潔級雄性SD大鼠40只，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCK（黔）2002～0001。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～25℃，相對濕度60%～65%。實驗期間，大鼠可自由攝食、飲水。

適應性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為4組：對照組（蒸餾水），以及低（2.4 mg/L）、中（12.0 mg/L）、高（60.0 mg/L）劑量染毒組，每組10只。采用自由飲水方式連續(xù)染毒6個月。每天測定并記錄大鼠體重，觀察大鼠外觀行為變化。

1.2　主要試劑

VEGF、VEGFR2兔抗鼠多克隆抗體（英國Abcam公司），細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程公司），亞砷酸鈉（分析純，北京化工廠）。

1.3　方法

1.3.1免疫組織化學法睪丸石蠟切片，用二甲苯化蠟至水，0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）微波修復15 min，冷卻至室溫，30 ml/L過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，10 ml/L Triton-100浸泡30 min增加細胞通透性，山羊血清37℃封閉30 min后加一抗（1∶50），4℃孵育過夜，恢復室溫40 min后滴加山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h，DAB顯色5 min，蘇木精復染2 min，常規(guī)脫水、透明、封片。以上步驟間均用0.01 mmol/L PBS（pH 7.0～7.4）洗3次，5 min/次。采用Olympus BX51顯微鏡拍照，IPP 6.0圖像分析軟件計算陽性細胞平均灰度值。

1.3.2末端標記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）取大鼠左側(cè)睪丸石蠟組織切片，按照細胞凋亡試劑盒說明書采用末端脫氧核苷酸介導的dUTP原位TUNEL檢測睪丸生精小管細胞凋亡情況。細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為凋亡細胞。每組隨機取3張連續(xù)切片，每張觀察5個視野，采用Mias圖像分析軟件測定凋亡細胞核的平均灰度值。

1.3.3精子形態(tài)觀察采用加樣槍每組吸取40μl精子懸液滴在載玻片上，用玻片將懸液輕輕推開，讓其自然晾干，甲醇固定10 min，晾干，1%伊紅染色10 min，流水沖洗、晾干。采用盲法在光學顯微鏡下觀察精子形態(tài)。

1.3.4精子活力測定取一側(cè)附睪，用37℃生理鹽水沖洗，眼科剪剪碎，37℃生理鹽水5 ml，吸管抽吸5次，37℃恒溫箱10 min，待精子充分游離后，采用偉力精子分析系統(tǒng)記錄精子濃度、精子活動率及各個活動精子濃度。

1.4　統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1　VEGF、VEGFR2在睪丸中的表達

2.1.1VEGF免疫組織化學法結(jié)果顯示，VEGF陽性產(chǎn)物主要位于睪丸精原細胞和支持細胞的胞質(zhì)及胞核、初級精母細胞及精子細胞的頂體、精子殘余體。各染毒組與對照組的VEGF灰度值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對照組較染毒組下降。見表1和圖1。2.1.2VEGFR2VEGFR2陽性產(chǎn)物主要位于睪丸精子細胞的頂體及精子頭部、精原細胞及支持細胞的胞質(zhì)及胞核。各染毒組與對照組的VEGFR2灰度值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對照組較染毒組下降。見表1和圖2。

表1　各組大鼠睪丸VEGF、VEGFR2灰度值比較（n=10，±s）

表1　各組大鼠睪丸VEGF、VEGFR2灰度值比較（n=10，±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05

對照組　109.60±0.41　90.12±0.37低劑量染毒組　127.80±0.62?　117.60±0.71?中劑量染毒組　136.70±0.95?　130.20±0.50?高劑量染毒組　145.00±0.60?　151.20±0.32?F值　36.941　5.981

2.2　睪丸生精小管的細胞凋亡情況

TUNEL染色結(jié)果顯示，凋亡細胞呈棕黃色，對照組睪丸生精小管偶見凋亡細胞，各染毒組上皮凋亡細胞核染色深，核固縮，體積比正常細胞小，染色質(zhì)濃縮聚集于核膜下。對照組，以及低、中、高劑量染毒組大鼠睪丸生精小管上皮細胞核灰度值分別為（92.42±0.36）、（133.0±0.72）、（150.32±0.23）和（164.20±0.85），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=56.692，P=0.000），各染毒組凋亡細胞數(shù)較對照組增多。見圖3。

2.3　精子形態(tài)

對照組精子形態(tài)正常，低劑量染毒組精子形態(tài)基本正常，偶見異常精子結(jié)構(gòu)不完整和尾部折疊；中劑量染毒組異常精子明顯增多，可見精子頭部與尾部分離畸形；高劑量染毒組正常數(shù)量明顯減少，畸形精子比例明顯升高，可見精子頭尾分離和尾部折疊現(xiàn)象。見圖4。

2.4　精子活力

各組大鼠精子濃度、精子活動率、活動精子濃度比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，各染毒組大鼠精子活動率、活動精子濃度較對照組低（P＜0.05）。與對照組比較，低劑量染毒組大鼠精子濃度較高，而中、高劑量染毒組大鼠精子濃度較低（P＜0.05）。見表2。

圖1　VEGF在大鼠睪丸生精小管中的表達（免疫組織化學法×400）

圖2　VEGFR2在大鼠睪丸生精小管中的表達（免疫組織化學法×400）

圖3　大鼠睪丸生精小管細胞核凋亡情況（TUNEL染色×400）

圖4　各組大鼠附睪精子涂片（伊紅染色×100）

表2　各組大鼠精子活力比較（n=10，±s）

表2　各組大鼠精子活力比較（n=10，±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05

活動精子濃度/%對照組　46.51±17.20　54.72±9.70　26.30±12.20低劑量染毒組　65.70±21.20?　43.20±12.80?　23.05±11.04?中劑量染毒組　23.20±5.10?　40.43±10.80?　12.05±5.01?高劑量染毒組　19.80±9.08?　37.53±9.86?　10.02±4.80?F值　6.486　5.031　8.872P值　0.016　0.018　0.003組別　精子濃度/（×106個/ml）精子活動率/%

3　討論

砷是一種廣泛存在于自然環(huán)境中的化學污染物和A類致癌物。VEGF及其受體是體內(nèi)與生殖相關(guān)的重要生長因子之一。VEGF能夠促進血管生成，在已發(fā)現(xiàn)的3種VEGF受體中，VEGFR2即KDR是血管發(fā)生和構(gòu)建的主要調(diào)節(jié)者。VEGFA與VEGFR2結(jié)合后能介導VEGF促進內(nèi)皮細胞增殖、促內(nèi)皮細胞存活作用與抗凋亡、促進內(nèi)皮細胞遷移、提高血管通透性[5-7]。

研究證明，VEGF與男性生殖及細胞凋亡有關(guān)。VEGF在睪丸中發(fā)揮重要作用，與生精功能的調(diào)節(jié)有關(guān)[8]。VEGF在附睪中起重要作用，參與附睪血管功能調(diào)節(jié)和微環(huán)境的形成[9]。VEGF與精索靜脈曲張有關(guān)[10]。VEGF與精囊、前列腺疾病有關(guān)[11]。睪丸生精功能受神經(jīng)—內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，多種生長因子和性激素在生精細胞的分裂、增殖、分化等過程中發(fā)揮重要作用[12-13]。睪酮可正向調(diào)節(jié)VEGF的表達，對男性生育能力起關(guān)鍵作用[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，慢性砷中毒對大鼠睪丸中促黃體生成素（luteotropic hormone,LH）有影響，且隨著亞砷酸鈉暴露劑量的增加，大鼠血清LH濃度呈下降趨勢[15]。砷中毒還導致雄性大鼠血清抑制素-B和睪酮分泌減少[16]。慢性砷中毒能導致精子受精能力降低[17]。本研究免疫組織化學法結(jié)果顯示，與對照組相比，各染毒組VEGF、VEGFR2表達水平呈下降趨勢，原因可能是隨著砷中毒劑量的增加和時間的延長，影響睪丸性激素尤其是睪酮的分泌水平下降，進而引起VEGF、KDR蛋白表達下調(diào)。

細胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細胞主動死亡的過程。病理狀態(tài)下可導致疾病腫瘤的發(fā)生。本研究中TUNEL法結(jié)果表明，與對照組比較，各染毒組大鼠睪丸生精小管上皮凋亡細胞灰度值較低，表明砷中毒可引起睪丸生精上皮細胞凋亡，且隨著染毒劑量的增加，生精小管上皮細胞凋亡水平逐漸升高。

附睪是精子成熟的場所，精子活力能夠反映雄性生殖毒性，也是決定生育能力的重要因素，而評價精子活力的指標主要有附睪內(nèi)精子濃度、活動率和活動精子濃度。研究表明，生精細胞的活動可受外源性化學物質(zhì)的影響，導致精子活力下降[18]。生精細胞的數(shù)量和成熟程度是精子生成的最初決定因素。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，低劑量染毒組大鼠精子濃度較高，而中、高劑量染毒組精子濃度較低。各染毒組大鼠精子活動率、活動精子濃度較低，可能與睪丸支持細胞的功能改變有關(guān)。

綜上所述，隨著砷中毒染毒劑量的增加和時間的延長，VEGF、VEGFR2表達水平逐漸下降，而生精上皮的凋亡水平逐漸升高。慢性砷中毒時可影響VEGF、VEGFR2的表達和睪丸內(nèi)微環(huán)境的形成，間接改變精子發(fā)生、發(fā)育，進而導致男性不育，但其具體機制有待進一步研究。