朱佳杰，沈夏霜，羅　偉，敖秋桅，譚　蕓，羅永巨，蔣和生，甘　西

(1.廣西大學(xué)，南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，南寧 530021)

1　材料與方法

1.1　試驗魚來源

試驗魚取自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院那馬淡水中試基地。選取同一個家系吉富羅非魚500尾，體重(56.48±1.70) g，試驗前對吉富羅非魚抽樣進行多重PCR檢測及平板劃線接種。將實驗魚暫養(yǎng)在5個塑料大桶中(容積5 000 L)，暫養(yǎng)14～15 d。暫養(yǎng)期間每天投喂專用羅非魚膨化顆粒飼料(深農(nóng)飼料公司2.0號浮料)2次(9∶00和17∶00)，按魚體重的3.5%進行投喂，每隔2 d更換二分之一水體，保持24 h增氧，水溫控制在31～32 ℃。暫養(yǎng)結(jié)束后，挑選400尾有活力的吉富羅非魚進行人工感染試驗。

1.2　無乳鏈球菌菌株復(fù)蘇與培養(yǎng)

試驗所用的無乳鏈球菌菌株(HN016)由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院魚病防治研究室饋贈，已證實該菌株為我國羅非魚主要養(yǎng)殖地區(qū)的優(yōu)勢菌株[16]。從-80 ℃冰箱中取出HN016菌株，解凍后先對該菌株進行毒力復(fù)壯。然后從發(fā)病魚的腦組織中分離病原菌接種到雞血平板上，32 ℃恒溫培養(yǎng)18-24 h，待雞血平板上長出菌落后，用接種環(huán)挑取單個菌落進行革蘭氏染色，檢測其是否攜帶雜菌。鑒定后在無菌環(huán)境下隨機挑取單個菌落置于200 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，在振蕩搖床上33 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后，經(jīng)平板計數(shù)測定菌液的濃度后用無菌生理鹽水將菌液濃度稀釋至注射半數(shù)致死濃度為1×107CFU/mL(前期多次測試過該菌株的半數(shù)致死濃度)，然后置于4 ℃冰箱保存待用。

1.3　實驗設(shè)計

實驗共設(shè)4個組，其中3個實驗組分別為注射組、灌胃組和浸泡組，另1組為對照組，無乳鏈球菌感染后各組魚均養(yǎng)殖在水溫31～32 ℃的大桶中。每個實驗組設(shè)2個平行組，每組各40尾魚，一組用于統(tǒng)計感染無乳鏈球菌后羅非魚的死亡規(guī)律，另一組用于體內(nèi)病原菌的分離。注射感染采用每尾魚腹腔注射0.2 mL濃度為1×107CFU/mL的無乳鏈球菌(HN016)方式；灌胃感染采用每尾魚灌胃0.2 mL濃度為1×107CFU/mL的無乳鏈球菌(HN016)方式；浸泡感染采用先將吉富羅非魚背部刮去部分魚鱗使其皮膚輕微刮傷，再將魚置于濃度為1×107CFU/mL的養(yǎng)殖水體中。實驗觀察為期10 d，每天早晚各投喂一次，感染后每隔2 h記錄實驗魚情況，若發(fā)現(xiàn)有發(fā)病魚及時撈出，死魚數(shù)量較多時要及時換水以保證水質(zhì)健康。

1.4　感染后組織病原菌的分離

三種方式感染后的2、5、8、12、24 h分別隨機取3尾魚進行解剖，采集試驗魚的腦、脾、肝、前腎、胃、腸、鰓、皮膚、肌肉等組織，用雞血平板進行病原菌的分離、培養(yǎng)，最后對菌落數(shù)目進行統(tǒng)計記錄。

1.5　病原菌的形態(tài)觀察與分子鑒定

形態(tài)觀察：用接種環(huán)挑取雞血平板上培養(yǎng)生長的單個典型菌落，在載玻片上進行革蘭氏染色，染色后在100倍油鏡下觀察細菌的形態(tài)。

分子鑒定: 吉富羅非魚感染無乳鏈球菌后的PCR鑒定參考[17]。

2　結(jié)果

2.1　吉富羅非魚感染無乳鏈球菌HN016菌株后的癥狀及死亡率

三種方式感染HN016菌株后，注射組、灌胃組均表現(xiàn)出明顯的發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)：魚體逐漸失去平衡，在水體中出現(xiàn)翻滾和旋轉(zhuǎn)現(xiàn)象，胸鰭及鰓蓋下緣出現(xiàn)彌漫性或點狀出血，眼球腫大充血、甚至混濁、眼球脫落等癥狀，剖檢側(cè)翻的病魚發(fā)現(xiàn)其膽囊、肝臟、脾臟明顯腫大，部分魚的腸道出現(xiàn)積水或黃色的黏液，肛門明顯發(fā)紅突出。

圖1　吉富羅非魚感染HN016菌株后累積死亡數(shù)量與感染時間的關(guān)系Fig.1　The relationship between cumulative mortality and post-infection time of O.niloticus infected by HN016 strain

由圖1可見，注射組和灌胃組在感染5 h后均出現(xiàn)發(fā)病死魚，其中注射組在感染后18～24 h出現(xiàn)死亡高峰期，之后逐漸趨向穩(wěn)定，試驗96 h內(nèi)共死亡37尾，死亡率為92.5%；灌胃組感染72 h后共死亡36尾，死亡率為90%；而浸泡組和對照組在整個感染期間均未出現(xiàn)發(fā)病癥狀。

2.2　病原菌的鑒定

將表現(xiàn)出疾病癥狀的病魚腦組織，接種于雞血平板上，33 ℃恒溫培養(yǎng)10 h，便可在顯微鏡下觀察到呈球狀或卵圓形的菌落，其直徑約為0.6～1.0 mm(見圖2)。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢可觀察到菌體為鏈狀或成對排列的革蘭氏陽性球菌(見圖3)，PCR鑒定結(jié)果也為無乳鏈球菌。

2.3　吉富羅非魚體內(nèi)病原菌分離

試驗組吉富羅非魚感染無乳鏈球菌后，注射組和灌胃組的魚除腦組織外其它組織在感染2 h后均可分離出無乳鏈球菌，注射組2 h菌落數(shù)目>30 CFU的組織為脾、肝、腎；而灌胃組2 h菌落數(shù)目>30 CFU的組織為胃、腸、鰓；5 h后這兩組的腦組織均能分離出無乳鏈球菌，且菌落數(shù)量隨感染時間的延長而增多。浸泡組在感染5 h后除腦組織外，在其它組織中均能分離出少量的無乳鏈球菌，12 h后體內(nèi)的無乳鏈球菌數(shù)量明顯下降，對照組則均未分離出無乳鏈球菌。見表1。

圖2　雞血平板上分離出的病原菌Fig.2　The separation of pathogens on blood agar plate

圖3　分離菌株的革蘭氏染色(A)及電鏡負染(B)照片F(xiàn)ig.3　The figures of gram stain (A) and electron microscope negative stain (B) of separation pathogens

3　討論

水產(chǎn)動物直接與外界環(huán)境接觸的黏膜組織如鰓、皮膚、腸道是病原細菌感染動物體內(nèi)的主要途徑，而作為第一道免疫屏障的黏膜組織在不斷地進化后形成硬骨魚類黏膜相關(guān)淋巴組織，才有完善的免疫體系用于抵抗病原細菌的侵染[18,19]。Minami[20]和 Kim等[21]研究發(fā)現(xiàn)黃尾鯡(Seriolalalandi)和牙鲆(Paralichthysolivaceus)是攝食了攜帶鏈球菌的雜魚而引起鏈球菌病爆發(fā)。Nguyen等[22]發(fā)現(xiàn)無乳鏈球菌是通過糞-口途徑在水體中接觸感染周圍的羅非魚,而Mian等[23]發(fā)現(xiàn)腹腔注射、浸泡和鰓接種均能使羅非魚魚感染鏈球菌,且后續(xù)研究也表明人工肌肉注射、強行喂食伴有細菌飼料以及鼻接種等都能使魚類感染鏈球菌。Patterson等[24]

表1　試驗組吉富羅非魚各組織細菌分離結(jié)果Tab.1　The isolated pathogenic bacteria in vivo after infection

注：“﹢”“﹢﹢”和“﹢﹢﹢”分別表示血平板上的菌落數(shù)目< 30CFU、> 30小于300CFU和>300CFU。

研究結(jié)果表明，人工進行腹腔注射感染無乳鏈球菌可以繞過其皮膚等黏膜組織的防御機制而直接感染魚體，從而導(dǎo)致更嚴重的病理變化。本研究采用注射、浸泡和灌胃三種方式進行感染，以期找出這三種方式感染后首先侵染的靶器官及病原菌在體內(nèi)的增殖變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射和灌胃兩種方式均可以使吉富羅非魚快速感染無乳鏈球菌而呈現(xiàn)發(fā)病癥狀，并在感染5 h后相繼出現(xiàn)死王。而浸泡組在高濃度浸泡感染后雖然在體內(nèi)分離出了無乳鏈球菌，但并沒有觀察到明顯的發(fā)病癥狀，且浸泡的水溫為31～32 ℃，已接近了自然條件下發(fā)病的水溫。由此可推測，浸泡感染方式不會引起羅非魚大面積爆發(fā)無乳鏈球菌病。本研究結(jié)果與Mian等[23]和 Soto等[25]報道的浸泡方式可以引起感染發(fā)病不一致，分析其原因可能是菌株的分型、毒力、濃度、感染的水溫及溶氧量等環(huán)境條件差異所造成的。

對感染無乳鏈球菌后的吉富羅非魚解剖發(fā)現(xiàn)多個組織器官出現(xiàn)變性、壞死及出血癥狀，尤其是肝臟、脾臟、腎臟和腦等重要器官功能障礙和衰竭,最后導(dǎo)致魚體死亡。其中注射感染組的魚首先在肝臟中分離出大量的病原菌，其主要原因是肝臟是魚類的供血器官和排毒器官，病原菌經(jīng)注射后進入體內(nèi)血液循環(huán)系統(tǒng)，快速到達肝臟組織，引起肝臟的功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致機體免疫機能下降，從而使病原菌突破機體的免疫防御系統(tǒng)，在體內(nèi)快速繁殖并破壞細胞的結(jié)構(gòu)，從而引起組織的病變。而灌胃方式首先在胃部、腸部和腮部分離得到較多的病原菌，其原因是由于病原菌直接通過口腔灌注入胃部和腸部，并在這兩個組織中滲透進入體內(nèi)血液循環(huán)系統(tǒng)，而在鰓部也分離出較多的病菌，可能與腮部存在豐富的毛細血管有關(guān)。浸泡感染5 h后在脾臟、肝臟、前腎、胃部、腸部、鰓部、皮膚及肌肉均可以分離出病原菌，但其數(shù)量比相同時期的注射組和灌胃組少，其主要原因是通過浸泡方式突破機體免疫系統(tǒng)的病原菌數(shù)量少，同時機體憑借自身的免疫防御系統(tǒng)又吞噬清除了部分病原菌，從而制約了病原菌在體內(nèi)的繁殖，所以并沒有表現(xiàn)出發(fā)病的癥狀。

4　結(jié)論

本研究結(jié)果表明注射、灌胃以及浸泡三種均可以讓吉富羅非魚感染無乳鏈球菌，其中注射和灌胃兩種感染方式均表現(xiàn)出了典型的無乳鏈球菌發(fā)病癥狀，而浸泡組在高濃度的無乳鏈球菌水體環(huán)境中雖然感染了無乳鏈球菌，但并沒有表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，也沒有出現(xiàn)死魚。由此我們推測，在自然條件下養(yǎng)殖的羅非魚是通過口腔攝食攜帶有無乳鏈球菌的食物而被感染。