崔　平，強(qiáng)　俊

(1.無錫職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇無錫，214121；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實驗室，江蘇無錫 214081)

瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)又名江黃顙，主要分布于長江及其支流中。分類上隸屬于鯰形目黃顙魚屬，是該屬中個體最大的一個種。該魚肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富、少肌間刺，是當(dāng)前我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，產(chǎn)量逐年增加[10]。水環(huán)境中，pH與氨氮對水生生物的影響存在相互聯(lián)系、相互制約的關(guān)系。然而，關(guān)于pH與氨氮對黃顙魚幼魚生長與肝臟抗氧化指標(biāo)之間是否存在互作效應(yīng)尚未見到相關(guān)報道。本研究在已有研究的基礎(chǔ)上，選取pH與氨氮兩個重要水環(huán)境影響因子，采用中心復(fù)合實驗設(shè)計(central composite design，CCD)與響應(yīng)曲面分析方法(response surface method，RSM)研究了不同pH與氨氮(ammonia nitrogen，AN)組合對瓦氏黃顙魚生長、飼料系數(shù)與超氧化物歧化酶活性的影響。近年來，CCD和RSM逐漸開始應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗，如羅非魚(Oreochromisniloticus)的人工授精與孵化技術(shù)與養(yǎng)殖條件的優(yōu)化等[11-13]。本研究不僅可以解析水體中不同pH與氨氮對黃顙魚生長與生理的變化規(guī)律，還能為實際生產(chǎn)中優(yōu)化其養(yǎng)殖條件，降低脅迫對其生長的抑制作用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實驗用魚

瓦氏黃顙魚選自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興繁育基地。選擇健康且活力良好的魚。將實驗用魚放置在室內(nèi)水泥池(水溫(27±0.3) ℃，pH 7.4～0.2)中暫養(yǎng)10 d，增氧機(jī)持續(xù)增氧，自然光周期。暫養(yǎng)期間，每天投喂沉性飼料2次，飼料中主要包含粗蛋白質(zhì)38%，粗脂肪5%，粗纖維12%，粗灰分15%，水分12%，總磷1%，鈣1%。

1.2　實驗設(shè)計與分組

正式實驗前，通過查閱文獻(xiàn)與預(yù)實驗，確定能夠抑制黃顙魚生長的氨氮濃度[14]。正式實驗采用CCD設(shè)計，響應(yīng)值分別為特定生長率(specific growth rate，SGR)，飼料效率(feed efficiency，F(xiàn)E)與肝臟超氧化物歧化酶活力(superoxide dismutase，SOD)。設(shè)計兩個實驗因子：pH(5～10)和氨氮(0.1～6.5 mg/L)，分別用pH和AN字母表示。分為2因素5水平，計算機(jī)編碼分別為-a，-1，0，1，a(表1)，共計13個實驗組。中心組合(計算機(jī)編碼：0和0)重復(fù)5次，每次實驗組合各設(shè)置3組平行。pH和AN的組合如表1所示。

1.3　實驗管理

實驗在39個塑料桶(0.8 m3)內(nèi)進(jìn)行。每個塑料桶加入曝氣3 d的自來水0.6 m3。通過HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié)水體pH值，采用德國WTW photoFlex測定水體pH值。利用電子恒溫棒(量程為20～34 ℃)將水溫控制在(27.5±0.5) ℃。同時，配制1 g/L的氯化氨母液，按照表1中的實驗組合，配制相應(yīng)的實驗濃度，使用奈氏試劑法測定與調(diào)整養(yǎng)殖水體的氨氮濃度。每個實驗組合中共放置75尾實驗魚(10.22±0.16) g，每個桶中各25尾。每天8∶00與17∶00各投喂1次，飼喂量為體重的1%～3%，實驗周期為7周。在整個實驗過程中，每3 d換水1/3，每隔6 h測定水中pH與氨氮濃度1次，及時調(diào)整濃度使其符合實驗要求。養(yǎng)殖期間通過增氧機(jī)連續(xù)增氧，自然光周期。同時，我們利用虹吸法每天清除桶底的殘餌與糞便。

表1　pH與氨氮濃度的試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.1　Experimental design and results of pH and concentrations of ammonia nitrogen (mean±SD)

注:(1) a =1.414 21為星號臂值，中心點(diǎn)重復(fù)5次；(2)表中pH和AN分別為pH值與氨氮濃度。

1.4　取樣與分析

禁食24 h后，分別從每個養(yǎng)殖桶中隨機(jī)選取8尾魚稱重。SGR與FE的計算方法如下：

SGR=100%×[Ln(終末體重)-Ln(初始體重)]/養(yǎng)殖周期

FE=總攝食量/(終末體重-初始體重)

另外每個實驗桶隨機(jī)選取3尾魚(3組平行共計9尾實驗魚)，利用MS-222(200 mg/L)深度麻醉1分鐘后，解剖取其肝臟，放入-80 ℃冰箱中用于下一步的SOD活性檢測。肝臟SOD活性的測定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，按照試劑盒中的說明進(jìn)行操作。

1.5　數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示?；陧憫?yīng)面分析方法，使用最小二乘法擬合因子與響應(yīng)值之間的二次多項式回歸方程：

2　結(jié)果

2.1　pH與AN對黃顙魚SGR的影響

pH與AN對黃顙魚SGR的影響見表1所示。通過最小二乘法進(jìn)行回歸數(shù)據(jù)的擬合。模型擬合有效(P=0.081 6>0.05)。pH與AN的線性和二次效應(yīng)對SGR具有顯著影響(P<0.05)。pH×AN的互作效應(yīng)對SGR無顯著影響。pH與AN對SGR的實際二次多項式回歸方程為：

SGR=-8.654+2.688 3pH+0.085 8AN+0.006 9pH×AN-0.180 3pH2-0.039 7AN2(R2=0.94；校正R2=0.89)

SGR的響應(yīng)面見圖1所示。通過動態(tài)曲面圖，可以評估實驗因子對黃顙魚生長的互作效應(yīng)。水體AN為0.1～6.5 mg/L時，幼魚的SGR隨pH值的上升呈先上升后下降的變化趨勢。當(dāng)pH為5～10時，幼魚的SGR在AN濃度為0.1～1.7 mg/L時無顯著差異；然而，AN濃度高于1.7 mg/L時，SGR顯著下降。pH和AN對SGR無互作效應(yīng)(P>0.05)。

圖1　pH、氨氮濃度及其互作效應(yīng)對黃顙魚幼魚特定生長率影響的等高線(A)和響應(yīng)曲面(B)Fig.1　Contour plot (A) and its response surface plot (B) for the effects of pH and AN on specific growth rate of juvenile

2.2　pH與AN對黃顙魚FE的影響

采用ANONA分析表1中FE實驗結(jié)果，擬合模型的P值為0.001(P<0.05)，缺適性檢驗的P值為0.126 3(P>0.05)，表明FE擬合模型非常適合。pH的線性效應(yīng)、AN的二次效應(yīng)與pH和AN的互作效應(yīng)對FE沒有顯著性影響。然而，AN的線性效應(yīng)和pH的二次效應(yīng)對FE有顯著影響。pH與AN對FE的實際二次多項式回歸方程為：

FE=-1.927 3+1.041 9pH-0.058 9AN+0.011 3pH×AN-0.071pH2-0.011 1AN2(R2=0.92；校正R2=0.83)

FE的曲線模型如圖2所示。pH為5～7.5時，幼魚的FE隨著水體AN濃度的升高(0.1～6.5 mg/L)呈顯著下降趨勢。pH高于7.5，AN在0.1～2 mg/L時，F(xiàn)E無顯著差異；然而，AN高于2 mg/L時，F(xiàn)E顯著下降。水體AN為0.1～6.5 mg/L時，F(xiàn)E在pH為7.5時擁有最高FE，升高或降低pH均會引起FE的下降。利用RSM對FE進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)pH和AN的組合為7.2和1.0 mg/L時，F(xiàn)E值最高(1.71)，可信度為0.883。

圖2　pH、氨氮濃度及其互作效應(yīng)對黃顙魚幼魚飼料效率影響的等高線(A)和響應(yīng)曲面(B)Fig.2　Contour plot (A) and its response surface plot (B) for the effects of pH and AN on feed efficiency of juvenile

2.3　pH與AN對黃顙魚肝臟SOD活力的影響

SOD活力的測量結(jié)果見表1。方差分析顯示，SOD擬合模型方程有顯著差異(P=0.004 1<0.05)，模型的缺適性檢驗>0.05(P=0.089 3)。AN的線性效應(yīng)與pH的二次效應(yīng)對SOD有顯著影響(P<0.05)。pH的一次效應(yīng)、AN的二次效應(yīng)與pH×AN的交互效應(yīng)對SOD無顯著差異。pH與AN對SOD的實際二次多項式回歸方程為：

SOD=-45.600 1+37.848 3pH-1.487 7AN-0.216 3pH×AN-2.437 6pH2+0.029 8AN2(R2=0.88；校正R2=0.79)

由圖3可以看出，水體pH為5～10時，黃顙魚肝臟SOD活力隨著AN的上升(0.1～6.5 mg/L)呈顯著的下降趨勢。當(dāng)水體氨氮為0.1～2 mg/L，SOD隨著pH上升(5～8)而增加；pH高于8時，SOD活力顯著下降。高TAH環(huán)境下，低pH或高pH對黃顙魚肝臟SOD活力有明顯的抑制作用。

圖3　pH、氨氮濃度及其互作效應(yīng)對黃顙魚幼魚肝臟超氧化物歧化酶活力影響的等高線(A)和響應(yīng)曲面(B)Fig.3　Contour plot (A) and its response surface plot (B) for the effects of pH and AN on the activity of superoxide dismutase in juvenile

2.4　黃顙魚SGR、FE與肝臟SOD模型的優(yōu)化

根據(jù)Montgomery[15]的方法，對不同pH與AN下的黃顙魚SGR、FE與肝臟SOD模型進(jìn)行共同優(yōu)化。pH與AN分別為7.5與1 mg/L時，黃顙魚的SGR、FE與肝臟SOD活力同時達(dá)到最高值，分別為1.47%/d，1.71和97.9 U/mg.prot，優(yōu)化的可信度為0.836。

3　討論

已有研究顯示，水體中高氨脅迫下會明顯抑制烏鱧(Anarhichasminor)[18]、虹鱒(Scophthalmusmaximus)[19]、羅非魚[13]和大西洋比目魚(Hippoglossushippoglossus)[20]的生長。本研究中，當(dāng)AN為0～2 mg/L時，黃顙魚的生長與飼料利用率無顯著抑制作用；然而，高AN濃度對黃顙魚的生長與FE有明顯的抑制作用。然而，Li等[21]利用3 g左右的黃顙魚(P.fulvidraco)實驗發(fā)現(xiàn)水體中高AN(5.7 mg/L)和低AN (0.01 mg/L)脅迫下時，黃顙魚的生長和存活率相比無顯著差異。魚體對AN脅迫的耐受力可能與其規(guī)格、品系與脅迫時間有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)AN對SGR存在顯著的二次效應(yīng)。pH=7.5，水體AN在1.7 mg/L時可以獲得黃顙魚最大SGR(1.49 %/d)，其可靠性為0.898。

環(huán)境脅迫下易引起魚體氧化應(yīng)激，增加組織的氧化損傷，主要涉及肝臟與腦神經(jīng)元中的N-甲基-D-天冬氨酸酯型谷氨酸受體的過度活化[22]，導(dǎo)致一系列活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)過度產(chǎn)生，引起蛋白質(zhì)的破壞[23]。在正常情況下，魚體可以通過自身的抗氧化防御體系，如提高SOD，過氧化氫酶與谷胱甘肽過氧化物酶的活力來降低ROS對機(jī)體的損傷。本研究中，高AN與高pH或低pH環(huán)境對黃顙魚肝臟SOD活力有明顯的抑制作用，可能因為較強(qiáng)的應(yīng)激脅迫使魚體的肝臟功能發(fā)生紊亂，降低了抗氧化防御能力，增加了氧化損傷，進(jìn)而抑制了黃顙魚的生長。同時，pH的二次效應(yīng)對SOD活力有顯著影響，當(dāng)水體AN為1 mg/L，肝臟SOD活力在pH為7.7時最高，為98.07 U/mg·prot，其可靠性為0.871。