馬志良　多杰

中圖分類號(hào) R927 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）02-0179-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.09

摘 要 目的：建立藏藥懸鉤木的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：從性狀特征、顯微特征、薄層色譜（TLC）等方面對(duì)藥材進(jìn)行定性鑒別；測(cè)定藥材水分、灰分、浸出物的含量。采用高效液相色譜法測(cè)定藥材中蘆丁和金絲桃苷的含量，色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（18 ∶ 82，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：藥材表面呈灰紅色至灰紅褐色，有縱向皺溝，外皮易剝離，髓部較大、疏松、呈海綿狀。藥材粉末呈淺黃色，木纖維成束或單個(gè)散在，韌皮纖維較粗。藥材樣品中金絲桃苷的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好；水分為6.71%～7.55%，總灰分為1.43%～1.67%，酸不溶性灰分為0.41%～0.48%，水浸出物為17.70%～19.31%，醇浸出物為13.76%～16.99%；金絲桃苷、蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍均為3.13～50 μg/mL（r分別為0.999 2、0.999 5）、定量限分別0.5、1.8 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.2、0.9 μg/mL，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2.0%（n=6），加樣回收率分別為92.8%～98.8%（RSD=2.25%，n=9）、94.0%～98.6%（RSD=1.71%，n=9）。結(jié)論：藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過10.0%、3.0%、0.6%；水浸出物、醇浸出物、蘆丁和金絲桃苷總量分別不得少于15.0%、12.0%、1.0 mg/g。所建標(biāo)準(zhǔn)可用于藏藥懸鉤木的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 藏藥；懸鉤木；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；蘆??；金絲桃苷；薄層色譜法；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the quality standard of Tibetan medicine Rubus biflorus. METHODS： The qualitative identification was conducted from characters characteristics， microscopic characteristics， TLC. The contents of moisture， ash and extract were determined. HPLC method was adopted for content determination of rutin and hyperoside. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution（18 ∶ 82，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 360 nm， column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The surface of the medicinal material was grayish red to grey red brown， with longitudinal wrinkle grooves， and the peel was easy to peel off. The pith of the medicinal material was large， loose， sponge-like. The powder of the medicine was light yellow； wood fiber was bundle or scattered individually； bast fiber was thick. TLC spot of hyperoside was clear and well-separated. The contents of moisture， total ash， acid-insoluble ash， water-soluble extract and ethanol extract were 6.71%-7.55%， 1.43%-1.67%， 0.41%-0.48%， 17.70%-19.31% and 13.76%-16.99%. The linear range was 3.13-50 μg/mL for rutin （r=0.999 2） and hyperoside （r=0.999 5）. The limits of quantitation were 0.5，1.8 μg/mL， and the limits of detection were 0.2，0.9 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. The recoveries were 92.8%-98.8%（RSD=2.25%，n=9），94.0%-98.6%（RSD=1.71%，n=9） . CONCLUSIONS： The moisture content， total ash and acid insoluble ash content of medicinal materials is not more than 10.0%， 3.0% and 0.6%， respectively. The total amount of water extract， alcohol extract， rutin and hyperoside is not less than 15.0%， 12.0%， 1.0 mg/g， respectively. Established standard can be used for quality control of Tibetan medicine R. biflorus.

KEYWORDS Tibetan medicine； Rubus biflorus； Quality standard； Rutin； Hyperoside；TLC；HPLC

藏藥懸鉤木始載于《四部醫(yī)典》，為藏醫(yī)常用藥材，藏文譯音為“干扎嘎日”[1]，為薔薇科懸鉤子屬植物粉枝莓（Rubus biflorus Buch.-Ham. ex Smith）的干燥去皮的莖或枝。其分布于我國陜西、甘肅、四川、青海、西藏等地，在印度西北部、克什米爾地區(qū)、巴基斯坦、阿富汗、伊朗等地也有分布[2]?！毒е楸静荨酚涊d：“懸鉤木味甘、苦、微辛，果味甘、酸，用于治隆熱病、培根病、浮腫，治肺病特效，亦治熱性時(shí)疫[3]?！睉毅^木藥材被廣泛用于藏藥復(fù)方制劑中，如十一味能消散、四味土木香散等[1]，其化學(xué)成分主要包括槲皮素、木犀草素、芹菜素、山柰酚、矢車菊素及其糖苷類以及金絲桃苷、蘆丁、粉枝莓素，二萜、三萜以及少數(shù)單萜，沒食子鞣質(zhì)、逆沒食子鞣質(zhì)、可水解鞣質(zhì)低聚體和咖啡鞣質(zhì)等[4-5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，懸鉤木具有活血化癖、清熱解毒之功效[6-8]。本研究結(jié)合2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，從性狀特征、顯微特征、薄層色譜（TLC）等方面對(duì)懸鉤木藥材進(jìn)行定性鑒別，測(cè)定藥材水分、灰分、浸出物的含量，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定藥材中蘆丁和金絲桃苷的含量，從而建立一個(gè)相對(duì)完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為保障該藥材質(zhì)量提供一定依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括二元梯度泵、2996紫外檢測(cè)器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；UPT-Ⅱ型超純水機(jī)（成都優(yōu)普超純水科技有限公司）。

1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201610，純度：>98%）、金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)：111521-201507，純度：>98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，甲醇為色譜純和優(yōu)級(jí)純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

懸鉤木藥材采集自青海、甘肅和西藏等地（見表1），經(jīng)中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所多杰教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

藥材樣品呈圓柱形，長(zhǎng)約 20 cm，直徑 0.4～0.8 cm。表面灰紅色至灰紅褐色，有縱向皺溝、突起的側(cè)枝痕及白色的皮刺基。外皮易剝離，剝離后呈紅褐色。易折斷，斷面不平坦，皮部較薄、呈紅褐色，木部黃白色至淺紅褐色。髓部較大，疏松呈海綿狀，呈白色至黃白色，體輕，質(zhì)堅(jiān)硬。氣微，味淡。

2.2 顯微鑒別

藥材樣品粉末呈淺黃色。木纖維成束或單個(gè)散在，壁較薄，壁孔不明顯，木射線寬1～3列細(xì)胞，射線細(xì)胞類方形，壁孔及紋孔明顯。韌皮纖維較粗，兩端稍鈍，胞腔較大。木栓細(xì)胞類方形或長(zhǎng)方形，黃棕色。草酸鈣簇晶較多，棱角圓鈍或稍尖，大小不等。具緣紋孔導(dǎo)管較大，紋孔較密。顯微特征詳見圖1。

2.3 TLC鑒別

取藥材樣品粉末（過2號(hào)篩）1.0 g，加甲醇20 mL，加熱回流60 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取金絲桃苷對(duì)照品適量，加甲醇制成金絲桃苷質(zhì)量濃度為2 mg/mL的對(duì)照品溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[9]試驗(yàn)，吸取上述2種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）為展開劑，避光展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁溶液，晾干，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見圖2。

2.4 水分測(cè)定

取10批藥材樣品粉末（過2號(hào)篩）適量，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（一部）附錄ⅨH水分測(cè)定法的第一法（烘干法）[10]測(cè)定其中水分，每批平行測(cè)定3份。結(jié)果顯示，藥材樣品水分為6.71%～7.55%，平均值為7.13%，詳見表2。初步擬定懸鉤木藥材水分不得過10.0%。

2.5 灰分測(cè)定

取10批藥材樣品粉末（過2號(hào)篩）適量，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（一部）附錄ⅨK灰分測(cè)定法[10]測(cè)定其中灰分。每批平行測(cè)定3份。結(jié)果顯示，藥材樣品總灰分為1.43%～1.67%，平均值為1.58%；酸不溶性灰分為0.41%～0.48%，平均值為0.45%，詳見表2。初步擬定懸鉤木藥材總灰分不得過3.0%，酸不溶性灰分不得過0.6%。

2.6 浸出物測(cè)定

取10批藥材樣品粉末（過2號(hào)篩）適量，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（一部）附錄ⅩA浸出物測(cè)定法[10]測(cè)定其中水浸出物和醇浸出物（乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%），每批平行測(cè)定3份。結(jié)果顯示，藥材樣品水浸出物為17.70%～19.31%，平均值為18.40%；醇浸出物為13.76%～16.99%，平均值為15.50%，詳見表2。初步擬定懸鉤木藥材水浸出物不得少于15.0%，醇浸出物不得少于12.0%。

2.7 含量測(cè)定

2.7.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（18 ∶ 82，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[11]。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以蘆丁和金絲桃苷峰計(jì)均不低于5 000；各成分基線分離良好，分離度大于1.5，詳見圖3。

2.7.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁、金絲桃苷對(duì)照品各5.0 mg，置于同一100 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容，搖勻，得蘆丁、金絲桃苷質(zhì)量濃度均為0.05 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.7.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末（過2號(hào)篩）0.500 g，置于100 mL回流圓底燒瓶中，加乙腈25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，70 ℃回流2 h；放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用乙腈補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.7.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.7.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋為原溶液質(zhì)量濃度的1/2、1/4、1/8、1/16，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述混合對(duì)照品原溶液和系列稀釋溶液各10 μL，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以蘆丁、金絲桃苷質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蘆丁、金絲桃苷回歸方程分別為y=147 120x+27 634（r=0.999 2）、y=227 953x-1 338 091（r=0.999 5）。結(jié)果表明，蘆丁、金絲桃苷檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍均為3.13～50 μg/mL。

2.7.5 定量限與檢測(cè)限考察 分別精密量取“2.7.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限。結(jié)果，蘆丁、金絲桃苷的定量限分別為0.5、1.8 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.2、0.9 μg/mL。

2.7.6 精密度試驗(yàn) 取“2.7.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、金絲桃苷峰面積的RSD分別為0.79%、0.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.7.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：XGM-1）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24 h時(shí)按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、金絲桃苷峰面積的RSD分別為1.01%、1.72%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（編號(hào)：XGM-1）適量，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，蘆丁、金絲桃苷含量平均值分別為0.930、0.280 mg/g，RSD分別為1.94%、1.06%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品（編號(hào)：XGM-1）適量，共9份，分別加入高、中、低質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.7.10 藥材樣品含量測(cè)定 取10批藥材樣品各適量，分別按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，藥材樣品中蘆丁和金絲桃苷總量為1.103～1.331 mg/g，平均值為1.203 mg/g，詳見表2。初步擬定兩者總量不得少于1.0 mg/g。

3 討論

筆者研究了藏藥懸鉤木藥材原標(biāo)準(zhǔn)中的性狀和顯微特征，增加了TLC鑒別，水分、灰分、浸出物與蘆丁、金絲桃苷的含量測(cè)定。在TLC預(yù)試驗(yàn)中，筆者考察了不同展開系統(tǒng)，并考察了不同點(diǎn)樣量（1、2、3、4 μL）對(duì)展開結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯-甲酸-水（8 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）為展開劑、點(diǎn)樣2 μL時(shí)，斑點(diǎn)清晰，效果最佳；另外，還考察了不同溫度、濕度、薄層板對(duì)展開結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)各條件對(duì)展開結(jié)果影響不大。

筆者對(duì)收集的10批懸鉤木藥材樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果水分為6.71%～7.55%，總灰分為1.43%～1.67%，酸不溶性灰分為0.41%～0.48%，水浸出物為17.70%～19.31%，醇浸出物為13.76%～16.99%，因此，暫定水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過10.0%、3.0%、0.6%，水和醇浸出物分別不得少于15.0%、12.0%。研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地懸鉤木藥材中蘆丁和金絲桃苷含量略有差異，結(jié)合藥材來源、存放等原因，為保證其臨床療效，暫定蘆丁和金絲桃苷總量不得少于1.0 mg/g。

綜上所述，所建立的標(biāo)準(zhǔn)可用于藏藥懸鉤木的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 青海省藥品檢驗(yàn)所， 青海省藏醫(yī)藥研究所. 中國藏藥：第一卷[M]. 上海： 上海科學(xué)技術(shù)出版社， 1996：102.

[ 2 ] 楊永昌. 藏藥志[M]. 西寧：青海人民出版社， 1991：38.

[ 3 ] 帝瑪爾·丹增彭措. 晶珠本草[M]. 毛繼祖，譯. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 2012：135.

[ 4 ] 甘露， 蔣鳳池. 粗葉懸鉤子化學(xué)成分的分離鑒定[J]. 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2000， 32（3）： 226-228.

[ 5 ] 孟祥娟， 劉斌， 折改梅，等. 懸鉤子屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2011， 23（4）： 767-775.

[ 6 ] 李維林， 賀善安， 顧姻. 中國懸鉤子屬植物的利用價(jià)值概述[J]. 武漢植物學(xué)研究， 2000， 18（3）： 237-243.

[ 7 ] 傅正生， 楊愛梅， 梁衛(wèi)東，等. 懸鉤子屬植物化學(xué)成分及生物活性研究新進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2001， 13（5）： 86-91.

[ 8 ] 孫長(zhǎng)清， 邵小明， 王黎明，等. 懸鉤子屬植物的開發(fā)利用概述[J]. 廣西植物， 2004， 24（6）： 578-582.

[ 9 ] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典：四部[S]. 2015年版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2015：57.

[10] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2015：103、202、204.

[11] 楊建冬， 鄧茂芝. 地稔藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 中國藥房， 2015， 26（6）： 818-820.

（收稿日期：2017-04-21 修回日期：2017-07-03）

（編輯：張 靜）