王曉英,郭廷松,王新花*,殷紅燕,李 慧,楊 波,高 紅,邊曉惠,孔風(fēng)芹

1.泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院,山東 泰安 271000

2.泰安市徂徠山林場,山東 泰安 271000

3.泰安市林業(yè)局,山東 泰安 271000

4.肥城市潮泉鎮(zhèn),山東 泰安 271000

元帥系蘋果的果實(shí)大，高樁，果面濃紅，色澤艷麗，果皮厚，肉質(zhì)松脆，酸甜適口，芳香濃郁；幼樹樹勢強(qiáng)健，盛果期樹勢易衰弱，枝條粗壯，易形成短果枝，結(jié)果早，豐產(chǎn)，而果實(shí)耐貯藏性較差，果實(shí)容易軟化變綿[1]。不同元帥系品種在枝條、貯藏性等性狀間存在較大差異[2-6]，DNA分子標(biāo)記是現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展出來的一類重要的遺傳標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)資源的管理和鑒定、基因的定位與克隆等，目前應(yīng)用于蘋果種質(zhì)資源研究的分子標(biāo)記主要是RAPD、SSR、SRAP、AFLP[7-20]，相對而言，AFLP標(biāo)記能夠提供的信息量更大，多態(tài)檢出率更高，且穩(wěn)定性好，重復(fù)性強(qiáng)[21,22]，而AFLP分子標(biāo)記應(yīng)用較少[18-20]。本試驗(yàn)以不同元帥系蘋果品種為研究材料，利用AFLP技術(shù)進(jìn)行遺傳分析，通過對基因組DNA的限制性酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增而揭示特有基因，從基因水平直接反映品種間差異，突破傳統(tǒng)方法的局限性，為新品種選育和鑒定提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試蘋果品種共4個(gè)(表1)：(1)紅星；(2)泰山紅星，是紅星變異品種，泰山林場栽植，經(jīng)多年栽培觀察，其生長勢強(qiáng)，果實(shí)可在室溫下自然放置2～3個(gè)月，到春節(jié)食用，比紅星蘋果的貯藏時(shí)間長；(3)沂蒙短枝紅星；(4)授粉品種金冠，均由泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院蘋果種質(zhì)資源圃提供。

表1 蘋果品種名稱Table 1 Apple variety name

1.2 操作步驟

1.2.1 基因組DNA提取 用改良CTAB法提取蘋果基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 限制性酶切及連接 0.5 mL離心管中加入20 μL反應(yīng)體系（DNA模板4 μL，Adapter 1 μL，PstI/MseI 2 μL，10×NEB buffer 2.5 μL，10m mol/LATP 2.5 μL，5 U/μL T4 Ligase 1 μL，H2O 7 μL），混勻離心數(shù)秒，37℃保溫5 h，8℃保溫4 h，4℃過夜。PstI接頭1:5′＞CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA＜3′，MseI接頭1:5′＞GAC GAT GAG TCC TGA G＜3′；PstI接頭2:5′＞ TGTACG CAG TCTAC＜3′；MseI接頭2:5′＞TAC TCA GGA CTC AT＜3′。

1.2.3 預(yù)擴(kuò)增 25 μL 反應(yīng)體系（模板 DNA 2 μL，10 mmol/L 預(yù)擴(kuò)引物 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10× PCR buffer 2.5 μL，2 U/μLTaq酶 0.5 μL，ddH2O 18.5 μL）離心數(shù)秒，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 94 ℃ 2 min，30輪循環(huán)（94℃30 s，56℃30 s，72℃80 s），72℃5 min，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 選擇性擴(kuò)增 預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋后作為選擴(kuò)模板，按25 μL體系（模板DNA2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，1 mmol/L dNTP 0.5 μL，1 mmol/LPstI引物 1 μL，1 mmol/LMseI引物 1 μL，2 U/μL Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 17.5 μL）混勻后，離心數(shù)秒，進(jìn)行PCR循環(huán)，第一輪擴(kuò)增參數(shù)：94℃30 s，65℃30 s，72℃80 s，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃，擴(kuò)增12輪。接著按94℃30 s，55℃30 s，72℃80 s擴(kuò)增23輪，延伸加時(shí)，72℃5 min。

1.2.5 凝膠分析 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物和上樣緩沖液比例為8:3，渦旋混勻，95℃變性，8 min后，立即冰浴，取4 μL上樣到ABI 377測序儀，進(jìn)行4%聚丙烯酰胺凝膠電泳，自動(dòng)采集原始膠圖。對照(Marker)為 ROX500分子量內(nèi)標(biāo)。電泳結(jié)束后用Genescan3.1從原始膠圖中提取數(shù)據(jù)，然后用Binthere將片段的大小提取出來，再用Excel將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成0和1數(shù)據(jù)，用Ntsys2.10進(jìn)行聚類分析。用Max comp程序?qū)垲惤Y(jié)果和相似系數(shù)矩陣之間的相關(guān)性進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選和多態(tài)性分析

通過對64對AFLP引物的篩選，篩選出了12對多態(tài)性較強(qiáng)且擴(kuò)增產(chǎn)物清晰的引物組合(表2)。

表2 12對AFLP引物標(biāo)記條帶數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 12 pairs of band numbers of AFLP primer markers statistics

12對引物共擴(kuò)增條帶826條，其中多態(tài)性帶595條；平均1對引物擴(kuò)增條帶69條，多態(tài)性帶50條，多態(tài)百分比為72.0%。12對引物組合均能揭示DNA多態(tài)性，其中引物Pst I GAC/Mse I CTA擴(kuò)增出多態(tài)性條帶最少為31條，多態(tài)性比例最小為55.4%，Pst I GAT/Mse I CAT擴(kuò)增的多態(tài)性帶為68條，多態(tài)性比例最高為93.2%。

2.2 凝膠分析

利用篩選得到的12對引物對4個(gè)蘋果品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物長度介于70～500 bp之間，結(jié)果條帶清晰。4個(gè)蘋果品種經(jīng)其中6對引物擴(kuò)增的電泳圖譜見圖1。

圖1 6對引物的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of 6 pairs of primers（6對引物：Pst I GAA/Mse I CAA、Pst I GAG/Mse I CAC、Pst I GAG/Mse I CAG、Pst I GAC/Mse I CAT、Pst I GAT/Mse I CAA、Pst I GAT/Mse I CAT）

2.3 品種的多態(tài)性分析

泰山紅星蘋果共擴(kuò)增出558個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶351條，顯著多于其他3個(gè)種質(zhì)，多態(tài)性比率最高，為62.9%，含有102條特有帶；沂蒙短枝紅星和紅星擴(kuò)增出條帶分別為517、497條，多態(tài)性條帶分別為310、290條，特有帶分別為64和55條。金冠共擴(kuò)增出380個(gè)條帶，多態(tài)性條帶173條，多態(tài)比例最低，為45.5%，其特有帶為59條（表3）。

表3 4個(gè)蘋果品種多態(tài)性分析Table 3 Genetic diversity analysis of 4 varieties of apple

2.4 遺傳相似系數(shù)分析

4個(gè)品種間遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.5846～0.7515，紅星、泰山紅星和沂蒙短枝紅星間遺傳相似系數(shù)較高，其中紅星和沂蒙短枝紅星間遺傳相似系數(shù)最高為0.7515。金冠與其他供試品種的遺傳相似系數(shù)都較小，說明其間遺傳距離較遠(yuǎn)（表4）。

表4 4個(gè)蘋果種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficients of 4 varieties of four apple germplasm

2.5 聚類分析

基于AFLP的擴(kuò)增結(jié)果，用NTSYS2·10進(jìn)行UPGMA聚類分析，得到4個(gè)蘋果種質(zhì)的親緣關(guān)系樹狀圖(圖2)。將聚類結(jié)果進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)為0.802，達(dá)到極顯著水平，表明聚類結(jié)果很好地體現(xiàn)了4個(gè)蘋果品種間的親緣關(guān)系。從聚類結(jié)果圖可以看出，AFLP標(biāo)記可將供試的4個(gè)品種完全區(qū)分開。

基于AFLP技術(shù)進(jìn)行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)閡值0.65處作切割線，將4個(gè)品種分為2類。第I為金冠，第Ⅱ類由3個(gè)品種組成，分別為紅星、泰山紅星和沂蒙短枝紅星，三者親緣關(guān)系較近，遺傳相似系數(shù)范圍為0.7050～0.7515。

圖2 4個(gè)蘋果品種的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMAdendrograms of four apple cultivars

3 結(jié)論與討論

祝軍等[22]用AFLP分子標(biāo)記的PstI/MseI體系的4對引物在25個(gè)品種中共擴(kuò)增出了224條不同分子量DNA帶，4對引物共發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)122個(gè)，占55.0%，平均每條引物擴(kuò)增56條不同分子量DNA帶，本研究采用AFLP分子標(biāo)記的PstI/MseI體系篩選出了12對多態(tài)性較強(qiáng)且擴(kuò)增產(chǎn)物清晰的引物組合，在4個(gè)蘋果品種中共擴(kuò)增出826條DNA片段，其中多態(tài)性條帶為595條，多態(tài)性位點(diǎn)所占比例為72.0%，平均每條引物擴(kuò)增69條不同分子量DNA帶，擴(kuò)增DNA帶和多態(tài)性位點(diǎn)比例顯著提高，因此本AFLP分子標(biāo)記技術(shù)體系可應(yīng)用于蘋果遺傳多樣性與品種鑒定。

蘋果分布較廣，基因組雜合度高，在長期的自然演化和種間雜交過程中，形成了生態(tài)適應(yīng)性差異較大、數(shù)量龐大的變異新種和新的無性系，進(jìn)行傳統(tǒng)的遺傳育種費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且費(fèi)用較高，近年來DNA分子標(biāo)記技術(shù)在蘋果上的發(fā)展和應(yīng)用，成為蘋果遺傳育種研究的重要方法和輔助育種手段[23]。本研究利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對3個(gè)元帥系蘋果品種的DNA標(biāo)記結(jié)果表明，泰山紅星、沂蒙短枝紅星和紅星擴(kuò)增出條帶分別為558、517、497條，其中多態(tài)性條帶分別為351、310、290條，說明3個(gè)元帥系蘋果品種的遺傳物質(zhì)存在差異，需對其遺傳規(guī)律進(jìn)行深入研究。

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