付 麗,曲健祿,武海斌,范 昆

山東省果樹研究所,山東 泰安 271000

蘋果輪紋?。˙otryosphaeria dothidea），又名粗皮病、輪紋爛果病，主要分布于中國、韓國、朝鮮、日本等國家，可危害多種經(jīng)濟林作物[1]。隨著中國蘋果產(chǎn)業(yè)結構調整及栽培模式的改變，感病品種“富士”的大面積栽培，使得該病害在中國蘋果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，不僅田間為害果實，還會引起采后果實腐爛，成為貯藏期重要病害[2]；隨著套袋技術的推廣，果實輪紋病的發(fā)生情況有所減緩，但是枝干輪紋病的發(fā)生卻有逐年加重的趨勢，據(jù)調查，我國蘋果枝干輪紋病總體發(fā)病率達77.6%，山東，河南等地發(fā)病率多達100%[3]。

施用化學殺菌劑是目前防治蘋果輪紋病的有效措施之一，眾多研究結果表明，戊唑醇是目前防治蘋果輪紋病的有效藥劑之一[4-6]。它通過引起病原菌細胞膜透性變化，導致細胞壁加厚從而阻礙病原菌與外界物質的交換[7]，導致病原菌死亡。不同抗性的病原菌以及敏感性菌株對滲透壓的敏感性有差異，甚至無明顯規(guī)律[9-11]。電導率是衡量溶液中離子強度高低的一個特征參數(shù)，它與細胞中組分如RNA、DNA、氮或碳等物質的含量無關，而與溶液中離子濃度有關[12]。細胞膜是戊唑醇的作用靶標，藥劑對細胞膜的影響可以用電導率值的變化來衡量[13]，多個試驗證明敏感菌株同抗性菌株的細胞膜透性存在差異[14-16]。本研究以本課題組收集的蘋果輪紋病菌抗戊唑醇菌株和敏感菌株為材料[17]，比較了各菌株對滲透壓的敏感性以及不同濃度戊唑醇處理后電導率的變化，明確了戊唑醇對蘋果輪紋病菌不同菌株滲透壓、細胞膜透性的影響，分析了蘋果輪紋病菌對戊唑醇產(chǎn)生抗藥性的生理生化機制，以期為藥劑抗性的分子機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

TS1為供試敏感菌株，采用常規(guī)組織分離法[18]分離自山東省泰山南天門未施用過戊唑醇的蘋果樹上。UV-TS1-10為紫外誘導獲得的戊唑醇高抗性菌株，抗性倍數(shù)達67.88[17]；F-TS1-5、F-TS1-7為戊唑醇藥劑連續(xù)馴化36代獲得的中、低抗菌株，抗性倍數(shù)分別為25.16倍、5.24倍。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株對滲透壓的敏感性測定 參照陳夕軍等[9]報道的方法并略有改進。供試菌株于PDA平板上、28℃培養(yǎng)5 d后，從菌落邊緣打取直徑7 mm的菌餅，分別接種于含葡萄糖5、10、20、40、80、100、150 g/L和含NaCl質量濃度為0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 g/L的PDA培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫條件下培養(yǎng)5 d，測量菌落直徑，每處理重復4次。

1.2.2 藥劑對菌株細胞膜透性的影響 參照石志琦等[19]報道的方法并略有改進。將供試菌株于PDA平板上、28℃ 下培養(yǎng)5 d后，制成直徑7 mm的菌餅，分別接入PDA平板中央，28℃培養(yǎng)7 d。刮取新鮮菌絲，用重蒸水沖洗，真空抽濾近干后稱取鮮菌絲2.0 g放入三角瓶中，分別加入質量濃度為0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 μg/mL的戊唑醇藥液，于28℃恒溫水浴中振蕩（120 r/min）培養(yǎng)不同時間后，用DDS-11A型電導儀分別測定藥劑處理0、10、20、30 min及1、1.5、2、3、4、5、6、7、9 h時的電導率。每個濃度重復3次，以菌絲加重蒸水煮沸10 min為對照。

式(1)中:Ct為某一時刻的電導率值；C0為最初(0 min)時的電導率值；C死處理為死處理后的電導率值。

2 結果與分析

2.1 不同抗性菌株和敏感菌株對滲透壓的敏感性比較

2.1.1 不同葡萄糖濃度引起的滲透壓變化對菌落直徑的影響 由圖1可以看出，在含不同濃度葡萄糖的PDA培養(yǎng)基上，蘋果輪紋病菌敏、抗菌株菌絲生長趨勢一致，菌絲直徑隨葡萄糖濃度的增加而增大。敏感菌株TS1、高抗菌株UV-TS1-10、中抗菌株F-TS1-5、低抗菌株F-TS1-7均在葡萄糖濃度小于80 g/L時，菌絲生長隨葡萄糖濃度增加而緩慢增加，當濃度為80～100 g/L時不同菌株菌絲直徑變化出現(xiàn)差異，敏感菌株TS1、高抗菌株UV-TS1-10和低抗菌株F-TS1-7的菌落直徑急速上升，其中以TS1的上升幅度最大，UV-TS1-10次之，F(xiàn)-TS1-7的上升幅度最小；F-TS1-5的菌落直徑?jīng)]有變大反而降低，最終的數(shù)值與TS1的菌落直徑大小相似，仍然高于UV-TS1-10和F-TS1-7的菌落大小。葡萄糖濃度大于100 g/L時所有菌株的菌落直徑均呈下降趨勢，但菌落直徑的大小依然高于80 g/L濃度時的大小。同一葡萄糖濃度下敏感菌株及不同抗性菌株的生長差異較大，中抗菌株和低抗菌株的菌絲生長情況明顯好于敏感菌株，高抗菌株生長狀況差于敏感菌株，表明高抗菌株在低高滲透壓環(huán)境下均比敏感菌株、低抗菌株和中抗菌株敏感。但是葡萄糖的濃度在大于80 g/L以后，不同菌株的生長狀態(tài)就與無葡萄糖的對照培養(yǎng)基相似，呈菌絲稀疏的狀態(tài)。這表明敏、抗菌株對高滲透壓均較為敏感，但對低滲透壓和中等滲透壓敏感性相對較低。

圖1 培養(yǎng)基中不同葡萄糖濃度對敏、抗菌株生長的影響Fig.1 Effect of different dextrose concentrations on the growth of sensitive and antibacterial strain in culture medium

2.1.2 不同氯化鈉濃度引起的滲透壓變化對菌落直徑的影響 不同NaCl滲透壓環(huán)境對敏感菌株和抗性菌株生長的影響見圖2。NaCl濃度小于10 g/L時，敏感菌株、抗性菌株的菌落直徑均隨NaCl濃度的增加而緩慢變大，低抗菌株F-TS1-7、中抗菌株F-TS1-5的菌落生長狀況優(yōu)于敏感菌株TS1和高抗菌株UV-TS1-10；NaCl濃度在10 g/L時，敏、抗菌株的菌落直徑均達到最大值；隨著NaCl濃度的不斷增大，敏感菌株及各抗性水平菌株的菌落直徑均迅速減小，且各菌株間變化幅度差異不大。由此可見，敏、抗菌株對NaCl低滲透壓和高滲透壓環(huán)境均比較敏感。

圖2 培養(yǎng)基中不同氯化鈉濃度對敏、抗菌株生長的影響Fig.2 Effect of different concentrations of NaCl on the growth of sensitive and antibacterial strain in culture medium

2.2 戊唑醇對不同抗性和敏感菌株細胞膜透性的影響

戊唑醇對敏感菌株和抗性菌株細胞膜透性的影響測定結果見圖3，如圖所示，在A（0 μg/mL）、B（0.10 μg/mL）、C（1.00 μg/mL）、D（10.00 μg/mL）、E（50.00 μg/mL）、F（100.00 μg/mL）六種處理條件下，敏感菌株TS1及各抗性菌株UV-TS1-10、F-TS1-5、F-TS1-7的整體相對滲透率隨戊唑醇處理濃度的增加均呈現(xiàn)上升的趨勢：其中UV-TS1-10菌株的相對滲率最高，其次是F-TS1-7、F-TS1-5和TS1。不同藥劑濃度處理下，UV-TS1-10菌株的相對滲透率一直最高，說明其細胞膜的通透能力最強，對戊唑醇的排泄能力最強；而TS1菌株的相對滲透率一直最小，說明其細胞膜的通透能力最差，對于戊唑醇藥劑的反應最敏感；低、中抗菌株的相對滲透率變化幅度較大，但也存在相似的趨勢，說明其細胞膜的通透能力也發(fā)生了較大的變化。相同戊唑醇濃度處理下，UV-TS1-10菌株的相對滲透率也高于F-TS1-7、F-TS1-5和TS1菌株；TS1菌株的相對滲透率變化趨勢不明顯；F-TS1-7、F-TS1-5菌株的相對滲透率變化趨勢明顯，但是依然低于UV-TS1-10菌株。這也說明相同處理中高抗菌株的細胞膜通透性也要好于低抗、中抗和敏感菌株。結果表明戊唑醇對蘋果輪紋菌株敏、抗性菌株細胞膜都有損傷，且損傷程度隨著處理藥劑濃度的增大而增加。

圖3 不同濃度戊唑醇處理后對敏、抗菌株相對滲透率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of tebuconazole on relative permeability of antimicrobial strain

3 討論

微生物在高滲透壓環(huán)境的脅迫下，大多都可以合成或從環(huán)境中吸收一些低分子量物質來調節(jié)自身的滲透壓以平衡外界滲透壓的增高。這些低分子量的物質包括K+、糖類(海藻糖、蔗糖)、醇類、氨基酸及其衍生物(脯氨酸、甜菜堿)[8]。夏曉明等[11]研究發(fā)現(xiàn)，抗戊唑醇禾谷絲核菌對滲透壓的敏感性要低于敏感菌株；葉滔等[7]研究抗戊唑醇禾谷鐮孢菌的滲透壓發(fā)現(xiàn)，其滲透壓的敏感性低于敏感菌株；任璐等[20]研究抗戊唑醇蘋果斑點落葉病菌對滲透壓敏感性發(fā)現(xiàn)沒有直接的聯(lián)系。本研究比較了不同抗性水平突變體和敏感菌株的滲透壓敏感性差異，結果顯示，在不同濃度的葡萄糖和NaCl處理的培養(yǎng)基中，敏感菌株和高抗菌株對滲透壓的敏感性均高于中、低抗菌株，其中高抗菌株的敏感性還要高于敏感菌株，說明高抗菌株對于環(huán)境變化的適應性更差，而中抗菌株和低抗菌株的適應性較強。該結果與夏曉明等[11]，葉滔等[7]和任璐等[20]的結果有所不同：但與我們前期研究結果[17]一致，在多地蘋果果園采集的輪紋病菌菌株中存在低抗菌株和中抗菌株，而未發(fā)現(xiàn)高抗菌株。不同抗性水平的菌株的細胞膜的通透性發(fā)生了變化，導致滲透壓的調節(jié)能力變化，但導致表現(xiàn)差異的原因尚待研究。

細胞膜透性大小可以用電導率來表示，電導率的高低反映了單位時間內細胞膜通過物質量的大小[12]。有研究表明[11]，戊唑醇本身就能引起病菌細胞膜透性變化而導致細胞死亡。本研究比較了不同濃度戊唑醇處理后，不同抗性水平突變體和敏感菌株的膜透性變化，結果表明，高抗菌株一直表現(xiàn)為高相對滲透率，敏感菌株表現(xiàn)為低相對滲透率，但是中抗菌株和低抗菌株的相對滲透率浮動明顯，說明高抗菌株的膜透性更好。這一結果與夏曉明[11]、葉滔[7]、任璐[20]等人的研究結果相似，說明在較短時間內，抗性菌株可以更快的將殺菌劑排出體外，抗性越高排出速度越快，而敏感菌株對于戊唑醇更敏感?？梢?，不同抗性水平菌株藥劑處理后膜透性的差異與其抗藥性的強弱有關聯(lián)，究其原因還需進一步研究探討。

綜合蘋果輪紋病菌敏感菌株和抗性菌株滲透壓敏感性及膜透性變化研究發(fā)現(xiàn)，敏、抗菌株對于高滲透壓和相對電導率變化存在差異。高抗菌株在高濃度藥劑處理下的電導率雖然相對滲透率最高，但其適應高滲透壓的能力較弱；敏感菌株在高滲透壓和電導率的反應中都表現(xiàn)為敏感；低、中抗菌株對于滲透壓和電導率的適應性保持均衡。表明低、中抗菌株對于不同環(huán)境的適應性較強，而敏感菌株和高抗菌株的對于環(huán)境的適應性較弱，說明戊唑醇依然是防治蘋果輪紋病菌的有效藥劑，但是田間用量和使用次數(shù)的控制顯得尤為重要。

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