吳斌，蘇立明，肇慧君，蔡曉萍，關(guān)鵬

（1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧　大連　116001；2.中檢集團(tuán)遼寧公司，遼寧　大連　116001）

病毒性出血性敗血?。╒iral haemorrhagic sep ticaemia，VHS）是由彈狀病毒引起鮭、鱒、狗魚和大菱鲆等十多種魚類的一種烈性傳染病，表現(xiàn)為出血性敗血癥，致死率達(dá)到90%以上[1]。該病主要流行于北半球，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）必須申報(bào)的疫病[2]，我國(guó)將其列為二類疫病。

目前國(guó)際上檢測(cè)VHSV通常采用的方法是細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒法，血清學(xué)方法、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法[3]以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[4]。細(xì)胞培養(yǎng)分離VHSV法結(jié)果可靠，但是檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適用于快速、高通量集成化鑒別診斷的要求。該試驗(yàn)首次將RT-PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）應(yīng)用于病毒性出血性敗血病病毒（VHSV）的檢測(cè)，以達(dá)到快速、準(zhǔn)確、高通量集成化檢測(cè)的目的。DHPLC是利用樣品分子通過(guò)離子對(duì)固定相親和力的差異，在用流動(dòng)相洗脫時(shí)，不同大小或者不同序列的核苷酸片段分子在固定相上移動(dòng)速率不同而達(dá)到分離的目的[5]。

1　材料與方法

1.1　病毒和細(xì)胞系

病毒性出血性敗血病病毒（VHSV）、傳染性造血組織壞死病病毒（IHNV）、傳染性胰臟壞死病病毒（IPNV）、鯉春病毒（SVCV）和鯉魚上皮瘤細(xì)胞系（EPC）均由遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2　主要試劑

PCR相關(guān)試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，三乙胺乙酰鹽（TEAA，色譜純）購(gòu)自Transgenomic公司，乙腈（色譜純）購(gòu)自Fisher公司。DHPLC緩沖液：緩沖液A為0.1 mmol/L TEAA；緩沖溶液B為0.1 mol/L TEAA+25%乙腈。

1.3　主要儀器

變性高效液相色譜儀器（Transgenomic Wave 4500）為北京環(huán)球基因公司產(chǎn)品；Allegra TM21R高速冷凍離心機(jī)為Beckman Coulter公司產(chǎn)品；ES-2全波長(zhǎng)紫外可見光分析系統(tǒng)為日本Malcom公司產(chǎn)品。

1.4　引物設(shè)計(jì)

選取病毒性出血性敗血癥病毒的糖蛋白（glycoprotein）基因序列 ,針對(duì)病毒的高保守區(qū)域,用Primer Explorer V3軟件設(shè)計(jì)兩條特異性引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.5　RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)

首先用Trizol法從增殖的病毒液中提取病毒的RNA，再用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在PCR管中加入提取出的RNA模板5 μL、2 μL dNTP、0.5 μL RNA 酶抑制劑（20 U）、5 μL 的 5 倍逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液、1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（10 IU），加 DEPC 水至 25 μL。42 ℃反應(yīng) 60 min，合成cDNA。

對(duì)合成好的cDNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：引物 F1 和 R1 各 1 μL、10 倍緩沖液 5 μL、Taq DNA 聚合酶 5 U、dNTP 2 μL（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L），總反應(yīng)體系總體積為50 μL。反應(yīng)條件：94℃變性 5 min；94℃變性 30 s，55℃40 s退火，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃，8 min，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

用1.5%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，回收目的片段（大小為811 bp），將目的片段與pMD18-T載體連接，連接好的重組質(zhì)粒在感受態(tài)細(xì)胞DH5α中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用OMEGA Kit試劑盒對(duì)增殖的菌液進(jìn)行重組質(zhì)粒pMD18-T-VHSV-Sp抽提，測(cè)序鑒定。將測(cè)序結(jié)果與GENBANK上公布的多株VHSV核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

1.6　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DHPLC分析

DHPLC分析條件：該試驗(yàn)采用PS-DVB&C18DNASep色譜柱（4.6 mm×50 mm，粒度 3 μm），將PCR產(chǎn)物放入DHPLC進(jìn)樣室，上樣量為5 μL。預(yù)先設(shè)定基因片段大小為100~700 bp，檢測(cè)起始時(shí)間為0.5 min，洗脫液起始濃度為緩沖液 A液50.2%，B液49.8%；洗脫液由緩沖液A（0.1 mol/L三乙胺乙酰鹽）和緩沖液B（0.1 mol/L三乙胺乙酰鹽和25%乙腈）組成，柱溫50℃，結(jié)束時(shí)間為10 min，洗脫液終止?jié)舛葹榫彌_液A液50.2%，B液49.8%；流速為0.9 mL/min，用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)260 nm處獲得吸光度值，經(jīng)系統(tǒng)處理后，形成DHPLC峰型圖譜，進(jìn)行分析鑒定。

1.7　實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

首先確立熒光PCR的最佳反應(yīng)條件，分別對(duì)反應(yīng)體系中引物和探針濃度、鎂離子濃度、DNA聚合酶濃度、退火溫度及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了如下反應(yīng)體系為：RNA模板10 μL，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液（Mg2+，15 mM）5 μL，0.25 μL dNTP，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）0.25 μL，DNA 聚合酶（5 U/L）0.25 μL，上下游引物（10μM）各 1.5 μL，最后用DEPC水補(bǔ)足至總反應(yīng)體積25 μL。在LC 480熒光PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：42℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min 40個(gè)循環(huán)。

1.8　PCR-DHPLC檢測(cè)的特異性分析

分別提取 VHSV、IPNV、IHNV、SVCV 的 RNA，以其為模板按照RT-PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)設(shè)立滅菌水為空白對(duì)照，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行DHPLC分析。對(duì)其擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行鑒定，觀察是否有交叉反應(yīng)，分析該方法的特異性。

1.9　PCR-DHPLC與實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度試驗(yàn)

將提取的VHSV的RNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在260 nm波長(zhǎng)處的OD值，計(jì)算RNA的濃度為3×105pg，將其進(jìn)行10倍梯度系列稀釋，得到模板質(zhì)量濃度分別為：3×105pg、3×104pg、3×103pg、3×102pg、3×101pg、3×100pg、3×10-1pg，分別應(yīng)用PCR-DHPLC與實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行同步檢測(cè),確定并比較兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)限。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1　RT-PCR產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

將病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果通過(guò)DANSTAR序列比對(duì)軟件與GENBANK上公布的多株VHSV核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。同源性均在96%以上，說(shuō)明RT-PCR擴(kuò)增所得片段為該病毒的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1　病毒性出血性敗血癥病毒的DHPLC檢測(cè)圖譜

2.2　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DHPLC檢測(cè)結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DHPLC分析，5個(gè)平行試驗(yàn)均在10.2 min左右出峰時(shí)間出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，且重復(fù)性很好，如圖1所示。

2.3　PCR-DHPLC檢測(cè)的特異性試驗(yàn)結(jié)果

四種病毒均在相同條件下進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后，用DHPLC檢測(cè)，設(shè)置100~900 bp的相同檢測(cè)模式下進(jìn)行分析，病毒性出血性敗血癥病毒在10.2 min左右的出峰時(shí)間檢測(cè)到了其陽(yáng)性特征吸收峰，其他三種病毒經(jīng)檢測(cè)后在DHPLC分析圖譜中均未出現(xiàn)明顯的吸收峰。如圖2所示。

圖2　病毒性出血性敗血癥病毒特異性試驗(yàn)的DHPLC檢測(cè)圖譜

2.4　實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

采用針對(duì)病毒性出血性敗血癥病毒設(shè)計(jì)的探針及引物對(duì)四種病毒在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，如圖3所示，只有病毒性出血性敗血癥病毒出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，其他三種病毒均無(wú)擴(kuò)增曲線。

圖3　實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

2.5PCR-DHPLC與實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1PCR-DHPLC的靈敏度檢測(cè)結(jié)果由圖4所示，經(jīng)10倍梯度系列稀釋的7個(gè)稀釋度樣品，在DHPLC分析圖譜中，最低為3 pg的模板量可出現(xiàn)特征峰。

2.5.2實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果由圖5所示，5 pg的病毒核酸也出現(xiàn)了“S”型擴(kuò)增曲線，表明實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)限為3 pg，由于加入了一條特異性的熒光探針，使其比普通的PCR在檢測(cè)靈敏度上高出很多。

3　結(jié)論

圖5　實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果

病毒性出血性敗血癥是一種能夠感染鮭鱒魚類的烈性傳染性疾病，主要通過(guò)水體擴(kuò)散傳播病毒，在自然條件下受感染的病魚會(huì)通過(guò)糞便、尿液等排泄物迅速感染周圍魚類[6]。目前國(guó)際上檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒通常采用的方法是細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒法、血清學(xué)方法、以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[4]。細(xì)胞培養(yǎng)分離VHSV法結(jié)果可靠，但是檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適用于快速鑒別診斷，因?yàn)閂HSV是有囊膜的彈狀病毒，在用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)時(shí)容易與其他魚類彈狀病毒有交叉反應(yīng)，進(jìn)而影響到診斷的準(zhǔn)確性。

圖4　PCR-DHPLC靈敏度檢測(cè)結(jié)果

目前反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）是檢測(cè)該病毒比較常用的檢測(cè)方法。但是普通PCR需要結(jié)合電泳和紫外光成像系統(tǒng)來(lái)判定擴(kuò)增結(jié)果，這不僅使得操作繁瑣，檢測(cè)中還需要接觸到溴化乙錠、紫外燈，在一定程度上對(duì)操作者造成危害，電泳很難檢測(cè)出模板拷貝數(shù)較低的病毒核酸，這可能會(huì)產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象。熒光PCR檢測(cè)方法有著高靈敏度的特點(diǎn)，但是成本較高。為了簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟降低檢測(cè)成本提高準(zhǔn)確性以適應(yīng)高靈敏度高通量集成化的診斷要求，該試驗(yàn)建立了RT-PCR與DHPLC相結(jié)合的檢測(cè)方法，該方法將RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物用變性高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，最低可檢測(cè)出3 pg的核酸模板，其檢測(cè)限高于普通PCR兩個(gè)數(shù)量級(jí)[7]，與熒光PCR的最低檢測(cè)量一致，并且不需要設(shè)計(jì)熒光探針，降低了檢測(cè)成本，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法特異性較高，與其他彈狀病毒無(wú)交叉反應(yīng)，DHPLC特征圖譜可精確到幾個(gè)堿基的差異[8]，一次進(jìn)樣可自動(dòng)檢測(cè)數(shù)百個(gè)樣品，滿足了檢測(cè)的高通量自動(dòng)化的要求。綜上所述，該方法可應(yīng)用于進(jìn)出口岸貿(mào)易及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對(duì)VHSV的快速檢測(cè)。