路　璐

（西華師范大學環(huán)境科學與工程學院，四川 南充 637009）

0　引言

微生物遺傳多樣性及其功能多樣性是當今微生物生態(tài)學研究的熱點和難點。海洋環(huán)境中的微生物多樣性極其豐富，每升海水中有超過200萬種微生物類群[1]，它們通過參與碳氮硫等生命元素的生物地球化學轉(zhuǎn)化過程、污染物的降解和轉(zhuǎn)化等過程，在維持海洋生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定和平衡中發(fā)揮著重要作用[2]。然而，微生物群落的結(jié)構(gòu)極易受到水體理化性質(zhì)和生物指標的影響，因此其可以作為評估環(huán)境質(zhì)量的指標之一[3]。尤其在近岸海域中，海水環(huán)境常常受到陸地沖刷物、陸地污染排放物的影響，不同的近岸海域中由于受到各異的污染源影響，微生物的群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著的變化[4-5]。在以往的研究中，大多數(shù)通過探究近岸水體的理化性質(zhì)的空間分布規(guī)律，如重金屬[6]、有機污染物[7]、和營養(yǎng)鹽[8]等，來評估近岸海洋環(huán)境質(zhì)量。而相比如淡水環(huán)境水體，近岸海水中微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的分布信息卻知之甚少[9]。

傳統(tǒng)的海洋微生物多樣性研究方法，如實驗室富集分離的培養(yǎng)方法，對微生物生理生態(tài)功能的認識提供了便利，然而，環(huán)境中絕大多數(shù)菌群是難培養(yǎng)或難分離微生物，截至2003年，全球范圍內(nèi)僅分離培養(yǎng)出4 800種細菌[10]。在純培養(yǎng)體系中，組學技術(shù)可在基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組水平清楚闡釋單一微生物菌株的重要生理過程。然而，特定微生物的生理代謝功能是與其它生物及自然環(huán)境長期相互作用的結(jié)果[11]。與純培養(yǎng)體系相比，自然環(huán)境中微生物具有極其豐富的多樣性，在整體水平上清楚認知復雜環(huán)境中微生物群落生理代謝過程的分子機制具有較大難度。因此，人們對環(huán)境中微生物的種類及其功能的認識還是十分有限。而近些年，以非培養(yǎng)為基礎(chǔ)的分子生物學技術(shù)手段，如核酸分子限制性片段長度多態(tài)性（restricted fragment length polymorphisms，RFLP）、變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE），高通量測序等的迅速發(fā)展，我們已經(jīng)能夠在群落水平探知微生物的多樣性及其生理代謝功能，同時也發(fā)現(xiàn)了在傳統(tǒng)的研究技術(shù)手段下以往無法發(fā)現(xiàn)的微生物種類及功能[12]。其中，Illumina Miseq測序技術(shù)以其高通量、快速、準確度高等優(yōu)勢成為獲取環(huán)境微生物多樣性信息的主要途徑。16S rRNA基因在不同微生物種群中具有保守性，對環(huán)境樣品中16S rRNA基因的高通量測序是探究海洋微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的有力工具。

本文的研究對象為采自于深圳灣和大鵬灣的近岸海水，尤其是深圳灣，靠近深圳市區(qū)，人口密集，受陸地環(huán)境壓力影響較大。由于各類經(jīng)濟活動所帶來的各類排海污染物、地表徑流和降雨等進入深圳灣和大鵬灣，會持續(xù)對兩個區(qū)域造成影響，從而可能在這兩個海域形成不同海水生態(tài)環(huán)境，進而影響海水的微生物群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能。本研究采用Illumina Miseq測序平臺，綜合比較分析了深圳灣和大鵬灣近岸表層海水微生物多樣性差異，并預(yù)測其微生物生態(tài)功能差異。該研究成果對該兩處海域生態(tài)系統(tǒng)的保護修復和微生物資源開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　采樣點描述

樣品于2017年5月在大鵬灣和深圳灣采集，如封二圖1所示，分別在離岸約200 m進行表層海水的采集。為避免表層漂浮物質(zhì)的影響，用水樣采樣器采集深度在0.5～1 m的表層水，每個采樣點分別在3個點（5 m×5 m）隨機采集水體，混勻，共采集10 L水體，置于滅菌的玻璃采集瓶中。取其中的1 L水采用EMD MilliporeTmSterivex Sterile Pressure-Driven設(shè)備，原位進行過濾，將微生物過濾至0.22 μm孔徑的濾膜上。濾膜置于干冰盒中冷藏保存，用于后續(xù)DNA提取。剩余的海水置于冷藏盒(4℃)中，10 h內(nèi)運回實驗室以備后續(xù)化學分析。

1.2　樣品理化性質(zhì)分析

表層水的溶解氧、pH和溫度由原位YSI在線多參數(shù)水質(zhì)分析儀(YSI 6600 multiparameter probe,USA)測定。水體的溶解性有機碳（dissolved organiccarbon,DOC）采用TOC分析儀（Elementar-TOC&WaterAnalysis,Germany）測定。每個樣品指標設(shè)置3個重復測定。

1.3　水體DNA提取

對原位采樣時過濾微生物細胞所得的濾膜，進行無菌環(huán)境下剪切為碎片，對濾膜采用FastDNA?Spin Kit for Soil(MP Biomedicals company),按照試劑盒說明進行樣品DNA提取。提取的DNA分別用凝膠電儀成像和NanoDrop濃度測定（NanoDrop Technologies,Wilmington,Germany）等兩種方法評估DNA提取質(zhì)量。

1.4　Illumina Miseq測序及序列分析

對大鵬灣和深圳灣的海水總DNA，進行基于16S rRNA的Illumina Miseq測定，引物選用515/907擴增16S rRNA基因的V4～V5區(qū)段[13]。測序樣品采 用 QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0）進行分析。使用UCLUST序列比對工具，對獲得的序列按97%的序列相似度進行歸并和OUT劃分，獲得每個OUT所對應(yīng)的分類學信息。并使用QIIME軟件計算Alpha多樣性指數(shù)。用R軟件繪制對豐度前50位的屬進行聚類分析并繪制熱圖。菌群代謝功能預(yù)測采用PICRUSt通過將現(xiàn)有的16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)與代謝功能已知的微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫相對比，從而實現(xiàn)對細菌和古菌微生物群落代謝功能的預(yù)測[14]。

2　結(jié)果與分析

2.1　海水理化性質(zhì)及Miseq測序結(jié)果和多樣性比較分析

深圳灣較之大鵬灣，距離城區(qū)更近，可能受城市污水排放和海上橋梁建設(shè)等帶來的人為污染更多。而大鵬灣遠離城區(qū)，因此，兩者的水體理化性質(zhì)和群落結(jié)構(gòu)，可能會有差異。Stewart等也同樣提出，岸上的環(huán)境對近岸水體微生物群落有直接的影響，如通過水土流失，陸地源微生物進入水體，甚至有些致病菌對水體的污染可能對人類產(chǎn)生潛在的健康威脅[15]。如表1中所示，基于16S rRNA的Miseq測序共獲得了105 214條序列。序列稀釋曲線表明大鵬灣海水的微生物群落多樣性高于深圳灣（封二圖2a），且大鵬灣的微生物多樣性指數(shù)（Shannon和 Simpson）和豐富度指數(shù)（Chao 1和ACE）也都高于深圳灣。在序列相似度為97%下分析表明，在門分類水平上大鵬灣和深圳灣分別有678個和345個OTUs，大鵬灣的OTUs明顯比大鵬灣高出49.1%，且僅有99個OTUs相同（封二圖2b），說明兩個海域的水體中微生物種群有顯著差異。Feng等對長江入?？诘暮Ｋ醒芯恳舶l(fā)現(xiàn)，距離入?？诰嚯x不同的位置，微生物多樣性也有所差異[16]。

表1　海水理化性質(zhì)及其Miseq測序結(jié)果

2.2　海水微生物群落結(jié)構(gòu)比較分析

通過對測序數(shù)據(jù)的分析，分別在門、綱、目、科、屬5個分類等級水平上對大鵬灣和深圳灣微生物群落結(jié)構(gòu)做柱狀圖以比較其差異（封二圖3和封三圖4）。在門水平發(fā)現(xiàn)，大鵬灣和深圳灣的微生物群落結(jié)構(gòu)可以分別分23和10個門（封二圖3）。大鵬灣海水中的主導菌群為藍藻細菌（Cyanobacteria）51.6%、變形菌門（Proteobacteria）20.1%、擬桿菌門(Bacteroidetes)10.0%、放線菌門（Actinobacteria）9.3%、厚壁菌門（Firmicutes）5.4%、浮霉菌門（Planctomycetes）2.9%，而相應(yīng)的菌門在深圳灣中分別占64.6%、7.3%、9.9%、14.2%、0.1%、3.9%，且這五類菌群分別占大鵬灣和深圳灣微生物類群的99.3%和99.9%。這一群落結(jié)構(gòu)組成與Yang在廈門海的研究以變形菌門（91%）為主的微生物類群差異較大[17]。藍藻細菌的相對豐度在深圳灣高于大鵬灣。而深圳灣和大鵬灣水體微生物群落結(jié)構(gòu)中較高豐度藍藻細菌的存在，說明和近岸水域的富營養(yǎng)化所導致的藍藻爆發(fā)有直接關(guān)系[18]。

如封三圖4b，在綱水平發(fā)現(xiàn)，大鵬灣中的α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)(8.3%)與γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)(7.2%)比例為1.1∶1，而在深圳灣中，α-變形菌綱（5.8%）是γ-變形菌綱（1.1%）的5.3倍。

如封二圖3和封三圖4c，能分類到目水平的微生物類群在大鵬灣和深圳灣中分別為79和45個，深圳灣中，分類到目水平的主要菌群為藍藻細菌（Cyanobacteria subsectionl），占總菌群的62.6%。

在科水平（封三圖4d），大鵬灣和深圳灣的物種豐度分別為136和60（封二圖3）。其中，紅桿菌科（Rhodobacteraceae）在大鵬灣和深圳灣中豐度分別為5.6%和7.3%，紅桿菌科是海水中常見的菌科，在渤海灣[19]、廈門海[20]和南太平洋環(huán)流區(qū)7個站點的深海沉積物和底層海水樣品中都有廣泛分布[21]。且在深圳灣中的黃桿菌科（Flavobacteriaceae）(6.9%)和酸微菌科（Acidimicrobiaceae）(7.0%)的相對豐度比大鵬灣中相應(yīng)的菌群高5.8和2.3倍，其中，黃桿菌科的菌群中很多有能降解有機物的功能，如異戊二烯降解[22]、烷烴降解[23]和多環(huán)芳烴降解[24]等。其在深圳的富集可能由于該海水中受有機物的污染較之大鵬灣嚴重。

為了進一步探究大鵬灣和深圳灣在屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)的差別，封三圖5所示更直觀地顯示了兩個海域中不同菌群豐度的差異。在深圳灣中主導菌屬為隸屬于藍藻菌門的原綠球藻（Prochlorococcus），在總微生物群落的比例為60.0%。原綠球藻作為海洋生態(tài)環(huán)境的最初生產(chǎn)力，主要分布在北緯40°至南緯40°的開闊海域中，在表層海水至150 m深度的深層海水中都有分布，且在光照和營養(yǎng)豐富的區(qū)域中豐度較高[25]。且研究表明原綠球藻在水溫低于15℃時就難以生存[26]。深圳灣中原綠球藻較高的豐度可能由于該研究采樣時間在夏天，表層海水溫度在30℃，且深圳灣海水較之大鵬灣，水體營養(yǎng)程度更高[27]，更促使原綠球藻富集。大鵬灣中的主導菌屬為隸屬于藍藻菌門的未分類菌株（uncultured bacterium），只能分類到綱水平（Chloroplast）。該菌綱在很多海域中也有大量富集，均能在其基因組中檢測到葉綠素基因，為化能自養(yǎng)菌，且該菌屬中分離出的純菌株很多與氮固定相關(guān)[28]。

2.3　PICRUSt代謝功能預(yù)測

PICRUSt是通過微生物群落的16S rRNA基因序列與功能數(shù)據(jù)庫對比，從而推測出微生物群落的功能信息。其中，KEGG數(shù)據(jù)庫的核心為生物代謝通路分析數(shù)據(jù)庫，KEGG圖能實現(xiàn)對菌群代謝功能的預(yù)測。如封三圖6a所示，韋恩圖可以看得出，大鵬灣和深圳灣分別有6 099和5 534個預(yù)測的功能類群，其各特有的功能類群分別為548和19個，表明2種海洋水體的生態(tài)功能已有差異。如封三圖6b所示，大鵬灣在生物降解功能、脂質(zhì)代謝、酶系統(tǒng)和碳水化合物代謝等四個方面的功能基因都高于深圳灣，說明兩個海域所接受的環(huán)境污染都不同，也導致其生態(tài)功能的差異。該規(guī)律在淡水環(huán)境中也有發(fā)現(xiàn)，當在不同的污染水平下，微生物群落的生態(tài)功能，如降解多環(huán)芳烴、降解農(nóng)藥污染物、以及抗性基因等功能的豐度都有顯著差異[29]。

3　結(jié)論

本實驗通過基于16S rRNA基因的Illumina Miseq高通量測序，研究表明深圳大鵬灣和深圳灣表層海水中微生物多樣性顯著差異，其微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)的改變會直接影響水體的功能，可能具體會體現(xiàn)在物質(zhì)轉(zhuǎn)化、自凈功能的改變等方面。

1）大鵬灣的微生物多樣性和豐富度指數(shù)Shannon、Simpson、Chao1、ACE都明顯高于深圳灣的微生物多樣性和豐富度。

2）大鵬灣和深圳灣的微生物群落分別可分類為24和10個門，主導菌門都為藍藻細菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、浮霉菌門，分別占其總微生物群落的99.3%和99.9%，但各菌門的相對豐度有所差異。

3）大鵬灣和深圳灣在綱、目、科、屬等水平的分類結(jié)果表明，2個海水水體的菌群結(jié)構(gòu)都有差異。在屬水平分析表明，隸屬于藍藻細菌門的原綠球藻（60.0%）屬主導了深圳灣海洋水體，而大鵬灣的主導藍藻菌屬為未被分離出純菌株的菌群。未來設(shè)計實驗需進一步采用宏基因組等手段對其分類水平和功能進行鑒定。

4）PICRUSt代謝功能預(yù)測初步揭示了大鵬灣和深圳灣水體生態(tài)功能的差異，為未來從微生物角度進行生態(tài)環(huán)境評估和治理提供新思路和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。