林樹真，龍婷，段明慧，史慶龍，葛發(fā)歡，周丹

（1.廣州市金妮寶食用油有限公司，廣東廣州 511475）（2.中山大學南沙研究院，廣東廣州 511458）（3.中山大學藥學院，廣東廣州 510006）

油茶籽油是從山茶科油茶樹的種子中獲得，是我國最古老的木本食用植物油之一。中國是世界上山茶科植物分布最廣的國家，也是茶油最大的生產(chǎn)基地，此外東南亞、日本等國家有極少量的分布[1]。油茶籽油具有預防各種心腦血管疾病、延緩動脈粥樣硬化降血脂、降血壓等功效[2～4]，是一種優(yōu)質(zhì)的保健食用油。經(jīng)報道，油茶籽油的不飽和脂肪酸均高于橄欖油，理化特性與其也極為相似，從而被譽為“東方橄欖油”[5～7]。目前，油茶籽油被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為健康型高級食用植物油重點推廣，深受廣大消費者的青睞[8]。隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展和人民生活水平的提高，消費者對生活的品質(zhì)的要求越來越高，對日常所需的食用油脂的安全與品質(zhì)更加關(guān)注，要求也更為嚴格，因而優(yōu)質(zhì)的食用油逐漸成為現(xiàn)代生活的必需品。

食用植物油均由皂化物和不皂化物兩大部分組成，皂化物部分占99%左右，主要包括三酰甘油和游離脂肪酸，其中三酰甘油的脂肪酸主要由飽和脂肪酸和不飽和脂肪脂肪酸組成[9]。不皂化物占1%左右，包括游離醇、三萜烯、生育酚、維生素、甾醇和角鯊烯等成分。這些有益于人體健康的活性成分是評價植物油質(zhì)量的重要指標。

目前，國內(nèi)外油茶籽油的成分研究主要集中在脂肪酸的種類[10～12]，對不皂化物類的活性成分研究相對缺乏。任傳義等對油茶籽油等植物油中的主要化學成分進行了分析[13]，通過氣相色譜法對角鯊烯和β-谷甾醇進行了含量測定，液相色譜法對維生素E的含量的進行測定，但是針對油脂樣品的氣相檢測和液相檢測，必須分別制樣，過程繁瑣，方法復雜。

張東生、鐘冬蓮等[14,15]通過氣相色譜法等對油茶籽油中的角鯊烯進行了定量分析，成分分析單一。關(guān)于用液相方法同時測定油茶籽油中多種營養(yǎng)成分的文獻尚未見報道，本文建立了一種高效液相檢測方法，對油茶籽油中的生育酚、甾醇和角鯊烯的含量同時進行測定，并對方法的可靠性進行了全面的考察，為油脂的品質(zhì)分析提拱了有效的途徑，對于更好的開發(fā)和推廣油茶籽油資源和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 原料

油茶籽油來源于實驗室超臨界設(shè)備萃?。沪?生育酚標準品（阿拉丁，純度96%），β-谷甾醇標準品（阿拉丁，純度＞95%），角鯊烯標準品（阿拉丁，純度＞95%）；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck公司），二氯甲烷、甲酸（分析純，廣州化工廠），超純水自制。

1.2 儀器設(shè)備

實驗儀器：美國戴安高效液相色譜儀 UltiMate 3000（包括梯度泵SR-3000、自動進樣器WPS-3000、柱恒溫系統(tǒng)TCC-3000、檢測器DAD-3000、色譜工作站變色龍7.2）；色譜柱：Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。XS205 Dual Range型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KQ-500E超聲波處理器(昆山超聲設(shè)備有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HPLC色譜條件的建立

選用三種不同色譜柱：Phenomenon Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，考察對樣品的分離效果；在不同的波長（205 nm、210 nm、283 nm、300 nm）條件對比分析，選擇最佳波長。樣品流動相：100%甲醇；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；等度洗脫。

1.3.2 對照品溶液的配制

稱取10.0 mg的γ-生育酚，加甲醇定容于10 mL的容量瓶中，配制成濃度為1.00 mg/mL的γ-生育酚標準品儲備液；稱取10.9 mg的β-谷甾醇，加甲醇定容于10 mL的容量瓶中，配制成濃度為1.09 mg/mL的β-谷甾醇標準品儲備液；稱取13.9 mg的角鯊烯標準品于10 mL的容量瓶中，加入甲醇/二氯甲烷（V/V=1:1）溶液定容至刻度線，配制成濃度為1.39 mg/mL的角鯊烯標準品儲備液。

1.3.3 供試品的制備

稱取5 g左右的供試品于250 mL的容量瓶中，加入50 mL的1 mol/L的氫氧化鉀的乙醇溶液。于90 ℃的水浴鍋中回流 2 h。停止加熱，從回流管頂部加入50 mL水并旋轉(zhuǎn)搖動。

冷卻后轉(zhuǎn)移皂化液到250 mL分液漏斗中，加入50 mL正己烷，蓋好旋塞，用力搖1 min，倒轉(zhuǎn)分液漏斗，并小心打開旋塞，間歇地釋放內(nèi)壓，靜置分液漏斗，至溶液分層后（如果形成乳液，須加入少量乙醇溶液破乳）。

將下層皂化液放入第二只分液漏斗中。用相同的方法，每次用50 mL正己烷對皂化液萃取兩次。將三次收集的正己烷置于同一分液漏斗中。

用10%的乙醇水溶液，洗滌上述提取液，每次用量25 mL，并劇烈搖動，洗滌后棄去乙醇水溶液，每次棄去洗滌液后，保持分液漏斗中剩余2 mL洗滌液，然后將分液漏斗沿其軸成線旋轉(zhuǎn)，靜置數(shù)分鐘，使剩余的乙醇水相進一步分離，然后棄去。繼續(xù)用乙醇水溶液洗滌，直到洗滌液加入1滴酚酞后不呈現(xiàn)粉紅色為止。

通過分液漏斗的上口小心地將正己烷溶液轉(zhuǎn)移到至圓底燒瓶中，在 50 ℃條件下，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除掉溶劑。將燒瓶中的殘留物轉(zhuǎn)移至5 mL的容量中，加入甲醇/二氯甲烷（V/V=1:1）溶液定容至刻度線，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，進液相。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件建立

通過對Phenomenon Luna C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱子的考察和不同波長的紫外吸收考察，最終確定的HPLC色譜條件為：色譜柱：Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：100%甲醇；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：205 nm；等度洗脫。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the camellia oil

在確定的色譜條件下，通過測定“1.3.2”中的標準品的色譜圖，與樣品進行一一核對，對油茶籽油樣品中的相關(guān)組分進行了定性分析。結(jié)果如圖1所示定性出的三種營養(yǎng)成分為：γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯。

2.2 標準曲線的繪制

分別取適量的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯對照品，稀釋到不同的濃度，在“1.3.1”條件下，進行液相分析。以峰面積為縱坐標，標準品的質(zhì)量為橫坐標，繪制如下的標準曲線。γ-生育酚回歸方程為：y=237.89x-0.052，R2=1；β-谷甾醇的回歸方程為：y=5.32x-0.0053，R2=0.9999；角鯊烯的回歸方程分別為：y=80.15x-0.528，R2=0.9990。結(jié)果表明，γ-生育酚在 0.01～0.40 μg，β-谷甾醇在 0.44～10.94 μg，角鯊烯在0.01～0.55 μg 呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗

取γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯對照品溶液，各連續(xù)進樣6次，以對照品的峰面積計算精密度。結(jié)果如表 1所示，γ-生育酚的 RSD=0.19%，β-谷甾醇的RSD=0.47%，角鯊烯的RSD=0.86%。上述結(jié)果均符合試驗要求。

表1 γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯精密度試驗結(jié)果Table 1 Precision of γ-antisterility vitamin, β-sitosterol and squalene

2.4 穩(wěn)定性試驗

表2 γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Stability of γ-antisterility vitamin, β-sitosterol and squalene

取同一批次樣品，樣品按照“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件，于 0、2、4、6、8 h分別測定，以γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯的含量來考察穩(wěn)定性，結(jié)果如表2，γ-生育酚的RSD=1.92%，β-谷甾醇的RSD=1.72%，角鯊烯的RSD=1.88%。上述結(jié)果均符合試驗要求。

2.5 重復性試驗

取同一批號的樣品，平均制備6份，按照“1.3.3”項的方法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL，連續(xù)進樣，以γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯的含量來考察重復性。γ-生育酚的 RSD=0.86%，β-谷甾醇的RSD=1.48%，角鯊烯的RSD=1.32%。上述結(jié)果均符合試驗要求。

2.6 加樣回收率試驗

精密稱取已測含量的同一批樣品，按照“1.3.3”項的方法制備樣品，精密移取一定體積的上述溶液，加入適量的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯的標準品溶液，測定其含量，并計算回收率。結(jié)果如表4、表5和表6所示，γ-生育酚的 RSD=1.28%，β-谷甾醇的RSD=1.54%，角鯊烯的RSD=1.58%。上述結(jié)果均符合試驗要求。

表3 γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯重復性試驗結(jié)果Table 3 Repeatability of γ-antisterility vitamin, β-sitosterol and squalene

表4 γ-生育酚加樣回收率試驗結(jié)果Table 4 Average recoveries of γ-antisterility vitamin

表5 β-谷甾醇加樣回收率試驗結(jié)果Table 5 Average recoveries of β-sitosterol

表6 角鯊烯加樣回收率試驗結(jié)果Table 6 Average recoveries of squalene

2.7 樣品含量測定

取同一條件下制備的不同批次的超臨界萃取的油茶籽油，按照“1.3.3”項下的方法制備供試品溶液，檢測樣品中γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯的含量。油茶籽油液相色譜圖如圖1所示，檢測結(jié)果如表7所示，表明三批樣品的測定結(jié)果重復性較好。

表7 油茶籽油樣品中營養(yǎng)成分的含量(mg/100g)Table 7 Determination of nutrient content in camellia oil samples

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一種高效、快速檢測油茶籽油中的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯的方法。通過對該方法線性度、重復性、穩(wěn)定性和加樣回收率的考察，結(jié)果表明該方法有效可信，可以用于油茶籽油的品質(zhì)控制，對油茶籽油的推廣應用具有重要意義。在該方法下，對本實驗室超臨界提取的同一條件下，不同批次的油茶籽油進行了相關(guān)分析，重復性較好。