馮吉，李吉龍，馬睿，馬金鵬，王家琳，孫坤，王志兵

（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012）

虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖[1,2]，是我國(guó)著名的傳統(tǒng)中藥，具有利膽、止痛、散瘀、解毒、化痰和消炎等多種功效[2,3]?；⒄戎泻休祯?、多酚、蒽酮、多糖、鞣質(zhì)、酚酸和游離氨基酸等多種活性成分[4～6]。據(jù)《中國(guó)藥典》（2015版）報(bào)道，虎杖苷是虎杖中的主要標(biāo)志性成分，有抗腫瘤，抗氧化、抗自由基，保護(hù)肝臟和治療心血管病等作用[3]。因此，建立一種簡(jiǎn)單、高效、綠色的分析方法檢測(cè)虎杖中的有效成分，對(duì)于中藥虎杖及其醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要意義。

目前，常用于檢測(cè)虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇的方法主要有紫外分光光度法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]、定量核磁共振波譜法[9]和高效液相色譜法[10,11]等，由于高效液相色譜法具有分離效率高、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高、操作自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，常用于中藥有效成分的分離和檢測(cè)。常用于中藥活性成分的提取方法主要有熱回流提取法[12,13]、微波提取法[14～16]、超聲波提取法[17～19]、超臨界流體萃取法[20]和堿提酸沉法[21]等。但上述方法不僅需要易揮發(fā)的有機(jī)溶劑，而且處理過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

離子液體是在室溫下一種呈液態(tài)的熔融鹽，它由有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子組成。離子液體無(wú)味、不燃、揮發(fā)性低，化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性良好[22]，且對(duì)有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物具有良好的溶解性[23]，所以離子液體常代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑用于提取分離等領(lǐng)域[24]。由于離子液體與陰離子表面活性劑之間存在靜電相互作用，在一定濃度條件下導(dǎo)致兩者的混合溶液自發(fā)的形成互不相容的兩相，即雙水相體系[25]。因此，本研究首次采用超聲輔助的離子液體/陰離子表面活性劑雙水相體系提取虎杖樣品中的虎杖苷和白藜蘆醇，并通過(guò)高效液相色譜對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行定量分析與檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六種虎杖樣品分別購(gòu)于當(dāng)?shù)夭煌幏浚珠L(zhǎng)春）。樣品粉碎后過(guò)120目篩，于60 ℃下烘干至恒重，備用。標(biāo)準(zhǔn)品虎杖苷和白藜蘆醇，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，并使用甲醇配制成濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。色譜級(jí)甲醇，購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C4MIM][BF4]）、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C6MIM][BF4]）、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C8MIM][BF4]）購(gòu)于上海成捷化學(xué)有限公司；十二烷基苯磺酸鈉（SDBS），購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)于北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜儀配有二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Aglient公司；Zorbax SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm I.D.），美國(guó)Aglient公司；C18預(yù)保護(hù)柱（5 μm，7.5 mm×2.1 mm I.D.），美國(guó) Aglient公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，江蘇昆山超聲儀器有限公司；Allegra 5430R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 超聲輔助離子液體/陰離子表面活性劑雙水相萃取

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01 g虎杖樣品于10 mL離心管中，同時(shí)加入4 mL超純水（pH 7.0）和400 μL離子液體，手動(dòng)振搖30 s，混合均勻后，加入SDBS 0.16 g，渦旋混合2 min，并于30 ℃下超聲提取20 min（160 W，40 Hz），然后以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，此時(shí)形成雙水相，準(zhǔn)確讀取上相（離子液體相）體積，并吸取10 μL過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)行色譜分析。具體的操作流程如圖1所示。

圖1 超聲輔助離子液體/陰離子表面活性劑雙水相萃取流程圖Fig.1 Procedure of ultrasound-assisted ionic liquid / anionic surfactant aqueous two-phase extraction

1.4 色譜條件

流動(dòng)相由甲醇（A）-水（B）組成，梯度洗脫：0～6 min，38%A；6～12 min，38～70%A；12～22 min，70%A；22～25 min，70～38%A；25～35 min，38%A。流動(dòng)相流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

提取率計(jì)算公式見(jiàn)公式（1），回收率計(jì)算見(jiàn)公式（2）。本方法精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 離子液體的選擇

圖2 離子液體的體積對(duì)提取率的影響Fig.2 Effects of ionic liquid volume on the extraction yield

離子液體的結(jié)構(gòu)和組成是影響溶液雙水相行為的關(guān)鍵因素。當(dāng)SDBS用量為0.16 g時(shí)，考察了三種離子液體[C4MIM][BF4]、[C6MIM][BF4]、[C8MIM][BF4]對(duì)相分離的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)選用[C6MIM][BF4]和[C8MIM][BF4]作為離子液體時(shí)，隨著離子液體濃度的增加，樣品溶液始終保持澄清狀態(tài)。

當(dāng)選用[C4MIM][BF4]作為萃取劑時(shí)，隨離子液體濃度的增加，溶液中出現(xiàn)四種相行為：（1）當(dāng)離子液體用量低于320 μL時(shí)，溶液保持澄清狀態(tài)，為均相溶液；（2）隨離子液體體積增加，溶液的黏度不斷增加，當(dāng)離子液體用量為360 μL時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)分相界面，即雙水相；（3）當(dāng)離子液體用量為400 μL時(shí)，上相體積達(dá)到0.5 mL，此時(shí)目標(biāo)分析物的提取率達(dá)到最大值；這可能與離子液體和目標(biāo)分析物之間存在較強(qiáng)的 π-π堆積、靜電和疏水相互作用有關(guān)；（4）當(dāng)離子液體體積繼續(xù)增加時(shí)，雙水相體系的上相體積不斷增加，提取率則無(wú)明顯變化。從節(jié)約溶劑和富集倍數(shù)的角度考慮，本研究選擇400 μL[C4MIM][BF4]為萃取溶劑。離子液體體積對(duì)目標(biāo)分析物提取率的影響見(jiàn)圖2。

2.1.2 SDBS用量

當(dāng)[C4MIM]BF4的體積為400 μL時(shí)，考察SDBS質(zhì)量（0.08～0.20 g）對(duì)目標(biāo)分析物提取率的影響（見(jiàn)圖3）。當(dāng)SDBS用量從0.02 g增加到0.06 g時(shí)，溶液的黏度逐漸增加；當(dāng)SDBS用量達(dá)到0.08 g時(shí)，雙水相體系形成；當(dāng)SDBS用量從0.08 g增加至0.16 g時(shí)，目標(biāo)分析物提取率達(dá)到最大值；當(dāng)SDBS用量高于0.2 g時(shí)，相分離界面消失，形成均相溶液。因此，本研究選擇SDBS用量為0.16 g。

圖3 SDBS的用量對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of amount of SDBS on extraction yields

2.1.3 樣品溶液的pH值

圖4 樣品溶液的pH值對(duì)提取率的影響Fig.4 Effects of pH value on the extraction yield

溶液的pH值會(huì)影響目標(biāo)分析物的電離狀態(tài)和溶解度。所以，本研究考察了溶液pH（1～11）值對(duì)虎杖苷和白藜蘆醇提取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，當(dāng)溶液pH＜10時(shí)，目標(biāo)分析物的提取率基本不變，而溶液顏色隨pH值的增加而加深，當(dāng)pH＞11時(shí)，雙水相上相體積大幅增加，富集倍數(shù)減小，并有白色沉淀產(chǎn)生。為了便于操作，本研究選擇樣品溶液pH 7.0。

2.1.4 超聲時(shí)間

圖5 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.5 Effects of ultrasound time on the extraction yield

超聲波不僅能擊碎植物細(xì)胞壁，增加提取溶劑的穿透能力，提高萃取效率，而且能增大分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，利于雙水相體系的形成。因此，本研究考察了當(dāng)超聲功率為160 W時(shí)，超聲時(shí)間（0、5、10、15、20、30、40 min）對(duì)目標(biāo)化合物提取率的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)不使用超聲時(shí)，體系的分相時(shí)間大大增加，目標(biāo)分析物的提取率最低。隨超聲時(shí)間的增加，下相越來(lái)越澄清，體系的分相時(shí)間則大大減少，從圖5中可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，雙水相體系分相界面清晰，目標(biāo)物提取率最高。所以，本研究選擇超聲時(shí)間為20 min。

2.1.5 超聲功率

圖6 超聲功率對(duì)提取率的影響Fig.6 Effects of ultrasound powder on the extraction yield

從圖6可以看出，目標(biāo)分析物的提取率隨超聲功率的增加不斷升高，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min，超聲功率為160 W時(shí)，目標(biāo)分析物提取效果最好。因此，本研究選擇超聲功率為160 W。

2.2 方法評(píng)價(jià)

2.2.1 分析性能

配制含有虎杖苷和白藜蘆醇的一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳色譜條件下分析樣品，以分析物濃度（C）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各目標(biāo)化合物在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r＞0.9995；檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為2.8～12.3和9.4～41.1 ng/mL。通過(guò)1 d內(nèi)連續(xù)的分析5次虎杖樣品所得到提取率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為日內(nèi)精密度。通過(guò)連續(xù)分析5 d、每天分析一次虎杖樣品所得到提取率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為日間精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各目標(biāo)化合物的日內(nèi)和日間精密度分別為 2.81～3.27和4.67～6.31%之間。因此，本研究方法的重現(xiàn)性是令人滿(mǎn)意的。

2.2.2 回收率

為了研究本方法的準(zhǔn)確度，本實(shí)驗(yàn)分析了加標(biāo)樣品的回收率。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物回收率為86.88～94.13%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于 6.77%，這表明本法具有滿(mǎn)意的回收率和精密度，可用于中藥活性成分的提取與檢測(cè)。為了評(píng)價(jià)本方法的適用性，本研究對(duì)不同產(chǎn)地的虎杖樣品進(jìn)行了分析。

表1 分析性能Table 1 Analytical performance

表2 化合物的回收率Table 2 Recovery of chemical compounds

表3 不同產(chǎn)地樣品中虎杖苷和白藜蘆醇的含量Table 3 The content of polydatin and resveratrol in samples from different habitats

圖7 標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和樣品提取液(B)色譜圖Fig.7 Chromatograms of the standard solution (A) and the sample extract (B)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，樣品中的虎杖苷和白藜蘆醇的含量分別為16.92～37.78和1.56～6.06 mg/g。另外，不同產(chǎn)地虎杖中兩種成分的含量也有差異，這可能是由于光照、氣候以及土壤等條件的差異對(duì)虎杖中這兩種成分有影響。樣品色譜圖如圖7所示。

3 結(jié)論

本研究將超聲輔助萃取與離子液體雙水相萃取相結(jié)合，建立一種簡(jiǎn)便、高效、綠色的超聲輔助離子液體/陰離子表面活性劑雙水相萃取法，用于提取虎杖中的主要藥效成分，同時(shí)采用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)。本研究以離子液體代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑為萃取劑，避免了有機(jī)溶劑的揮發(fā)對(duì)環(huán)境及實(shí)驗(yàn)人員的危害。其他方法相比，本法具有樣品用量少、操作簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于中藥中多酚類(lèi)化合物的提取分析。